Guide général de cryoconservation de cultures de …

1 John Ryan, IncorporatedLife SciencesLowell, MA 01851, USAS ommaireIntroduction .. 1 Avantages de la cong lation de cultures cellulaires . 2 Principes de la cong lation de cellules .. 2 Aspects pratiques de la cong lation de cellules .. 3R f rences .. 10 IntroductionMaintenir en bonne sant des cultures de cellules encroissance est une tache exigeante rendue encoreplus difficile par le risque omnipr sent de leur pertepar accident ou contamination. De plus, les culturesde cellules en croissance active ne sont pas statiquesmais, comme toutes les populations de microorgan-ismes, soumises des modifications li es l' ge ouinduites par l'environnement qui peuvent conduire leur volution et leur perte conservation cryog nique permet de minimiserces probl mes en stoppant l'horloge biologique descultures cellulaires, les plongeant efficacement dansune activit r ellement suspendue.

2 Ce concept,longtemps un des stratag mes favoris des crivains etproducteurs de cin ma de science-fiction, est devenur alit depuis l'importante d couverte de Polge,Smith et Parkes (11) en 1949 selon laquelle le gly-c rol prot ge les cellules des l sions caus es par lacong lation. De nombreux protocoles dignes derecettes de cuisine sont maintenant disponibles pourcongeler des cellules, et ces proc dures fonctionnentg n ralement bien (3, 6, 13-16). Il est essentiel,cependant, lorsque des probl mes surgissent ou queles protocoles n cessitent une adaptation et desam liorations, de bien comprendre les concepts sous-jacents sur lesquels ils sont bas s. Ce Guide examineles concepts th oriques de base et les aspects pra-tiques n cessaires pour r ussir la cong lation de cel-lules animales et pour g rer une banque de g n ral de cryoconservation decultures de cellules animalesBulletin techniqueLife SciencesAvantages de la cong lation decultures cellulairesLa maintenance des cultures de cellulesn cessite peu de temps et d'effort lorsqu'ellessont correctement congel es et conserv seul r el co t sont les d penses de main-tenance d'un cong lateur m canique ultra-froid (-130 C ou moins) ou d'une alimenta-tion en azote liquide.

3 Ces d penses limit esvalent tr s largement le temps, l'effort et leco t substantiel des milieux et fournituresn cessaires au maintien en activit de cul-tures en croissance active, ou le co t d'unenouvelle culture obtenue partir d'unebanque. Les cultures congel es sont unesource importante de r serve de secours pourremplacer les pertes occasionnelles dues auxcontaminations ou aux accidents, et assurentune alimentation homog ne de cultures . Deschangements ou alt rations cellulaires survi-ennent dans toutes les populations en crois-sance active. Ces changements entra nentsouvent la perte de caract ristiques impor-tantes pendant l' volution des cultures ,introduisant ainsi des variables ind sirablesdans les exp riences de longue dur e. Lescultures conserv es par cryog nisation nesubissent apparemment aucune modificationd celable une fois conserv es en dessous de 130 C (1, 8). Par cons quent, les effetsbiologiques du vieillissement et de l' volu-tion cellulaires in vitro peuvent tre min-imis s en revenant fr quemment aux culturesstock congel es, permettant ainsi de termineravec succ s les exp riences de culture delongue dur e en cours sans subir de variablesind sirables.

4 Les cultures congel es assurent galement une ligne de base pr cieuse pourmesurer ou comparer les modificationsfutures induites par l'exp de la cong lation decellulesPour comprendre pourquoi les protocolesde cong lation fonctionnent, il est n ces-saire d'examiner les v nements intracellu-laires et extracellulaires qui surviennentdans les cultures de cellules animales pen-dant le processus de cong lation (2, 4, 8).La r frig ration initiale de la temp ratureambiante 0 C ralentit le m tabolisme cel-lulaire, interrompant rapidement le trans-port actif et la pompe ionique. Cette inter-ruption n'endommage g n ralement pas lacellule si le milieu de culture est osmotique-ment quilibr . Lorsque le refroidissementse poursuit (0 20 C), des cristaux deglace commencent se former dans l'envi-ronnement extracellulaire, ce qui augmentela concentration en solut s du milieu deculture. De ce fait, l'eau commence sortirdes cellules pour aller dans le milieu extra-cellulaire partiellement congel , ce qui ini-tialise le processus de d shydratation et der tr cissement le processus de refroidissement estrapide, des cristaux de glace intracellulairesse forment avant la fin du processus ded shydratation cellulaire.

5 Ces cristaux deglace d chirent les membranes et lesorganelles cellulaires et entra nent la mortde la cellule pendant le processus de d con-g lation (Figure 2). Lorsque le processus de r frig ration estlent, l'eau libre intracellulaire est expuls ede la cellule par la force osmotique, entra -nant une d shydratation et un r tr cisse-ment complets de la cellule. Ceci peut galement entra ner une mort cellulairemais il n'existe pas de consensus sur lesm canismes impliqu s. Les contraintesphysiques du r tr cissement cellulaire peu-vent provoquer quelques d g ts, entra nantune perte de membrane irr parable et uneperturbation du cytosquelette et desorganelles. Les concentrations lev es ensolut s dans le milieu extracellulaire noncongel (essentiellement de l'eau sal e) peu-vent galement provoquer des d g ts. Cessolut s attaquent les cellules par l'int rieuret l'ext rieur, endommageant la membraneet provoquant un d placement du pH etune d naturation g n rale des prot , lorsque la vitesse de refroidisse-ment est suffisamment lente pour emp cherla formation de glace intracellulaire, maissuffisamment rapide pour viter les effets ded shydratation graves, les cellules peuventsurvivre aux processus de cong lation et ded cong lation.

6 La zone ou fen tre de survieest facilement observable chez de nom-breuses bact ries ou autres procaryotes,mais pour la plupart des cellules eucaryotes,elle est inexistante ou tr s difficile trouversans utiliser d'agents cryoprotecteurs. Cesagents ont peu d'effet sur les dommagescaus s par une cong lation rapide (forma-tion de cristaux de glace intracellulaires),mais pr viennent ou diminuent g n rale-ment les dommages dus la cong lationlente (d shydratation et r tr cissement) (8).La temp rature finale de conservation est galement critique pour r ussir une cry-oconservation. Pour stopper enti rementl'horloge biologique, les temp ratures deconservation doivent tre maintenues en2 Avantages de lacong lation decultures cellulaires Moins de travail- conomisedu temps et de l'argent. Sert de r serve de secoursen cas d'urgence Fournit une population plushomog ne en min-imisant le vieillissement etl' volution de la de 130 C, point de transition vit-reuse en dessous duquel l'eau liquide n'ex-iste pas et la diffusion est insignifiante.

7 Bienque de nombreuses cultures cellulairessoient conserv es avec succ s entre -70 C etl'horloge biologique n'est pas stopp e, maisuniquement ralentie, et des alt rations oumodifications cellulaires vont s' conservation dans l'azote liquide 196 C pr vient efficacement toutes lesr actions chimiques thermod les effets physico-chimiques caus spar le rayonnement ionisant de fond esttoujours actif cette temp rature. Onestime qu'il faudrait des milliers d'ann esavant que ces rayonnements de fond ne pro-duisent d'effets notables sur les cellules cry-oconserv es (2, 8). 90 C pendant des moisou m me des ann pratiques de lacong lation de cellulesM mes dans les meilleures circonstances, leprocessus de cong lation reste stressantpour toutes les cultures cellulaires. Il estimportant de faire tout ce qui est possiblepour minimiser ce stress sur les cultures afinde maximiser leur r cup ration et survieult rieures.

8 Les suggestions et recomman-dations suivantes sont con ues pour com-pl ter les protocoles cit s pr c S lection des cellulesS'assurer d'abord que les cellules sont dansle meilleur tat possible. S lectionner lescultures proches de la fin de la phase decroissance logarithmique ( environ 90% deconfluence) et changer leur milieu 24heures avant de les r colter. Recherchersoigneusement toute trace de contaminationmicrobienne dans la culture. Cette proc -dure est facilit e par la culture des cellulesdans un milieu sans antibiotique pendantplusieurs passages avant de les tester. Cecilaisse du temps toute contamination r sis-tante ou cach e (pr sente en tr s petit nom-bre) d'atteindre un niveau plus lev et doncplus facilement d tectable. Examinerensuite des chantillons de ces cultures aumicroscope et les tester par culture directepour rechercher la pr sence de bact ries,levures, champignons et mycoplasmes repr sentent un probl meparticulier, car ils peuvent tre trouv s desconcentrations tr s lev es (jusqu' 108organismes par millilitre de milieu) dans lescultures sans effets ni turbidit , jusqu' 20% de toutes les cultures decellules animales sont contamin es par cesorganismes ubiquitaires mais les efforts particuliers n cessairespour d tecter les mycoplasmes, les con-s quences s rieuses de leur pr sence ren-dent absolument essentiel le test de tous lesstocks de cultures congel es (9, 12).

9 V rifier l'identit des cultures et la pr sencede toutes les caract ristiques particuli resattendues. Contr ler l'identit des cellulespar leur caryotype et leur analyse isoenzy-matique pour s'assurer qu'elles sont aumoins de la bonne esp ce (10).II. R colte des cellulesD marrer par la proc dure de r colte stan-dard g n ralement conseill e pour la cul-ture en tant aussi d licat que tous les agents de dissociation enlavant ou en les inactivant (particuli rementimportant en cas d'utilisation de milieu sanss rum). La centrifugation, lorsqu'elle estabsolument n cessaire, doit tre juste suff-isamment forte pour obtenir un culot sou-3 RefroidissementlentRefroidissementrapide Mort cellulaire pardommages dus auxcristaux de glaceinternesMort cellulaire pareffet ded shydratationMort cellulaire pardommages dus auxcristaux de glaceinternesLes cellules seD shydratent maissurviventSans CryoprotectionAvec CryoprotectionRefroidissementlentRefroid issementrapideFigure des vitesses de cong lation sur les cryoprotectionAvec cryoprotectionple : 100 x g pendant 5 6 minutes sontg n ralement suffisants.

10 Pour assurer l'uni-formit du stock final congel , rassemblerles contenus de tous les r cipients de cul-ture r colt s. Ceci facilite galement l'ex -cution des tests de contr le qualit essen-tiels pour la recherche des contaminationsmicrobienne et l'identification de la puis diluer ou concentrer la sus-pension de cellules r colt es pour obtenirdeux fois la concentration finale d sir e, quiest habituellement de 4 10 millions de cel-lules viables par millilitre. Un volume galde milieu contenant l'agent cryoprotecteur deux fois sa concentration finale seraajout plus tard pour obtenir l'inoculumd sir . Conserver les cellules au frais pourralentir leur m tabolisme et les emp cherde s'agr ger. viter toute d rive alcaline dupH en a rant avec du CO2si n cessaireIII. CryoprotectionComme mentionn pr c demment, lesagents de cryoprotection sont n cessairespour minimiser ou emp cher les d t riora-tions associ es la cong lation lente.