PARTE IV Métodos de propagación y conservación de …

1 PARTE IV. M todos de propagaci n y conservaci n de germoplasma Biotecnolog a y Mejoramiento Vegetal II 351. 352 Biotecnolog a y Mejoramiento Vegetal II. IV. CAP TULO 1 Etapa 0: Preparaci n del material vegetal La correcta elecci n y preparaci n del ex- planto incide directamente sobre la calidad del Micropropagaci n mismo y su respuesta frente a los dos principa- les problemas que afectan al establecimiento Sof a Olmos, Gabriela Luciani y del cultivo, que son la contaminaci n con mi- Ernestina Galdeano croorganismos y la oxidaci n del explanto. Los factores que influyen sobre la calidad del 1 Introducci n explanto son: el tipo de rgano que sirve como La micropropagaci n consiste en la propa- explanto, la edad ontog nica y fisiol gica del gaci n de plantas en un ambiente artificial con- mismo, la estaci n en la cual se colecta el ma- terial vegetal, el tama o y el estado sanitario trolado, empleando un medio de cultivo ade- general de la planta donante.

2 Cuado. El cultivo es as una herramienta muy La planta donante debe elegirse en base a til en los programas de mejoramiento, ya que una selecci n masal positiva para las caracte- tiene el potencial de producir plantas de calidad r sticas agron micas deseables. Una vez se- uniforme a escala comercial, a partir de un ge- leccionados los individuos, es preciso definir el notipo selecto y con una tasa de multiplicaci n tipo de explanto a establecer en condiciones in ilimitada. Esto es posible gracias a la propie- vitro. En general, los rganos j venes o bien dad de totipotencia que tienen las c lulas ve- rejuvenecidos son los que tienen mejor res- getales; esto es la capacidad de regenerar una puesta en el establecimiento que los obtenidos planta completa cuando est n sujetas a los es- a partir de materiales adultos. t mulos adecuados. As , las c lulas som ticas El empleo de explantos que se encuentran de cualquier tejido podr an formar tallos, ra ces expuestos a bajos niveles de pat genos puede o embriones som ticos de acuerdo con la com- resolver el problema de la contaminaci n por petencia que posea y al est mulo que reciban.

3 Hongos y bacterias durante el establecimiento Dependiendo de las caracter sticas de la del cultivo in vitro. planta que se pretenda propagar y del objetivo Se recomienda colectar explantos primarios perseguido, la micropropagaci n puede rea- a campo durante la estaci n primaveral y esti- lizarse a trav s de tres v as de regeneraci n: val, cuando existe una brotaci n activa de las brotaci n de yemas adventicias preexistentes, yemas, ya que el empleo de yemas en esta- producci n de yemas de novo y embriog nesis do de dormici n ocasiona serios problemas de som tica. contaminaci n. A fin de lograr explantos de ptima calidad 2 Etapas de la micropropagaci n es conveniente hacer crecer las plantas donan- La micropropagaci n presenta cuatro etapas tes por un tiempo m nimo en condiciones de principales: 1) establecimiento del cultivo, 2) invern culo. De esta forma es posible incidir desarrollo y multiplicaci n de v stagos o em- directamente sobre el estado sanitario y la ca- briones, 3) enraizamiento y 4) aclimataci n lidad de los explantos mediante el control de la de las pl ntulas.

4 Generalmente, las etapas de intensidad lum nica, temperatura y reguladores enraizamiento y aclimataci n pueden combi- de crecimiento. Para especies ornamentales narse en condiciones ex vitro. En el caso de tropicales y subtropicales se recomienda man- la embriog nesis som tica, el enraizamiento tener las plantas donantes en condiciones de es reemplazado por una etapa de maduraci n alta temperatura (25 C) y baja humedad rela- y germinaci n de los embriones para la dife- tiva (75%) a fin de reducir la proliferaci n de renciaci n de los pices caulinar y radicular. pat genos. En algunos casos tiene importancia considerar Los procesos morfog nicos de floraci n, una etapa previa (Etapa 0) que es la etapa de dormici n y bulbificaci n son controlados por el preparaci n de los explantos para el estableci- fotoper odo y la temperatura. Controlando es- miento. tos factores tambi n es posible obtener plantas Biotecnolog a y Mejoramiento Vegetal II 353.

5 Donantes y explantos m s homog neos duran- la carga de pat genos es mayor y por lo tanto te todo el a o. Pueden aplicarse adem s pre- la precisi n del sistema de detecci n aumen- tratamientos con reguladores de crecimiento a ta. Por otro lado, las plantas enfermas pueden las plantas donantes, as como tambi n a los tratarse con t cnicas adecuadas para la elimi- explantos mismos. En especies le osas suele naci n de pat genos como la termoterapia, la utilizarse como pretratamiento la inmersi n de quimioterapia a trav s de la aplicaci n de anti- los explantos primarios en soluciones con cito- bi ticos, desinfectantes, antivirales y el cultivo cininas a fin de inducir la brotaci n de yemas. de meristemas. La desinfecci n superficial incluye varios pa- Etapa 1: Establecimiento del cultivo sos: el lavado de los explantos con agua co- El objetivo de esta etapa es establecer culti- rriente, el empleo de etanol al 70% por 1 mi- vos viables y ax nicos.

6 El xito est determina- nuto, seguido de concentraciones variables de do por la calidad del explanto a utilizar. En esta hipoclorito de sodio (0,5 a 1,5% de cloro activo). etapa los principales procesos a controlar son con unas gotas de tensoactivos para favorecer la selecci n, el aislamiento y la esterilizaci n de su penetraci n y actividad. Posteriormente, los los explantos. explantos deben ser enjuagados al menos tres veces con agua destilada est ril. Los materiales que demuestran tener mayor Algunos pat genos permanecen latentes y capacidad regenerativa son los obtenidos de se expresan cuando son transferidos a un me- tejidos meristem ticos j venes, ya sean yemas dio de cultivo nuevo. En general, estos pat - axilares o adventicias, embriones o semillas en genos incluyen los pat genos superficiales del plantas herb ceas y aquellos tejidos meriste- material vegetal, los pat genos end genos y m ticos que determinan el crecimiento en gro- los pat genos propios del manejo en laborato- sor, como el cambium en las plantas le osas.

7 Rio. En la Etapa 1 tambi n pueden observarse En este sentido, es importante se alar que el infecciones por bacterias y hongos asociados a empleo de yemas adventicias (tambi n llama- trips que sobreviven a los tratamientos de este- das yemas formadas de novo) est asociado rilizaci n y por pat genos end genos latentes con una mayor probabilidad de ocurrencia de dentro del sistema vascular, resultado de una variantes somaclonales respecto de los siste- esterilizaci n inefectiva de los explantos. Estos mas de propagaci n basados en la regenera- pat genos latentes podr an manejarse median- ci n a partir de yemas axilares o embriones te el empleo de bacteriost ticos o antibi ticos som ticos. en el medio de cultivo. La obtenci n de cultivos ax nicos puede lo- grarse trabajando tanto sobre aspectos preven- Etapa 2: Multiplicaci n tivos como curativos. Una acci n preventiva la El objetivo de esta etapa es mantener y au- constituye el empleo de m todos de verifica- mentar la cantidad de brotes para los nuevos ci n de pat genos en los explantos.

8 Esto puede ciclos de multiplicaci n sucesivos (subcultivos). realizarse mediante an lisis espec ficos para y poder destinar PARTE de ellos a la siguiente las enfermedades del cultivo, tales como DAS- etapa de producci n (enraizamiento, bulbifica- ELISA o PCR, an lisis generales para pat ge- ci n, etc.). Ambas v as de regeneraci n, orga- nos cultivables como el empleo de medios de nog nesis y embriog nesis, pueden darse en cultivo para el crecimiento de bacterias y hon- forma directa o indirecta. Esta ltima implica la gos y m todos espec ficos para la detecci n e formaci n de callo. En general, la organog ne- identificaci n de pat genos intracelulares como sis conduce a la producci n de v stagos unipo- virus, viroides y bacterias. La realizaci n de lares que enra zan en etapas sucesivas, mien- estos an lisis directamente sobre las plantas tras que por embriog nesis som tica se forman donantes, previo establecimiento, presenta dos embriones bipolares a trav s de etapas onto- ventajas.

9 En primer lugar, el empleo de tejidos g nicas similares a la embriog nesis cig tica. maduros permite visualizar los s ntomas m s Es importante se alar que cualquiera sea la marcados de la enfermedad, en segundo lugar, v a de regeneraci n empleada, es convenien- 354 Biotecnolog a y Mejoramiento Vegetal II. te evitar la formaci n de callo para disminuir el La embriog nesis som tica es una v a m s riesgo de variaci n somaclonal. Los medios de conveniente porque permite saltar las etapas cultivo, los reguladores de crecimiento como de formaci n de yemas y enraizamiento, rege- auxinas, citocininas y cido giber lico y las con- nerando plantas en una forma mucho m s r - diciones de crecimiento juegan un papel cr tico pida y eficiente. A su vez, la disponibilidad de sobre la multiplicaci n clonal de los explantos. protocolos para la obtenci n de embriones so- La organog nesis puede darse por inducci n m ticos es clave para la automatizaci n de la de yemas axilares o adventicias.

10 La inducci n micropropagaci n y la consecuente reducci n de yemas axilares comprende la multiplicaci n de costos para su implementaci n a escala de yemas preformadas, usualmente sin forma- comercial. Los biorreactores son equipos que ci n de callo. La inducci n de yemas adventi- contienen aproximadamente 2 litros de medio cias comprende la inducci n de tejido meriste- de cultivo l quido est ril y donde los embriones m tico localizado mediante un tratamiento con som ticos pueden regenerar y madurar a partir reguladores de crecimiento, conduciendo a la de suspensiones celulares, sustentados por la diferenciaci n del primordio y desarrollo del circulaci n permanente de nutrientes y de aire v stago, esto ltimo generalmente en ausencia ( ). Hoy en d a, el empleo de biorreactores del regulador de crecimiento que indujo la orga- para la micropropagaci n a gran escala est . nog nesis. limitado por dos motivos cr ticos.