03-Medios de cultivos - Departamento de Protección Vegetal

1 1 Preparaci n de medios de cultivoCurso: M todos en fitopatolog a Dr. Pedro Mondino24 de abril de 2009 Objetivos Conocer a que denominamos medio de cultivo en el laboratorio de Fitopatolog a. Reconocer la existencia de diferentes tipos de medio. Reconocer la utilidad de los diferentes medios de cultivo en el trabajo con pat genos de El alumno debe: 1) ser capaz de elaborar medios de cultivo con el fin de ser utilizados posteriormente para el aislamiento de hongos, bacterias o microorganismos epif ticos. 2) Desenvolverse con soltura en la utilizaci n de protocolos. Medios de cultivo Los medios de cultivo de microorganismos (hongos, bacterias, levaduras) son esenciales en el Laboratorio de Fitopatolog a por lo que a diario se preparan y utilizan. Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en condiciones f sicas ptimas, permiten el crecimiento de los que debe reunir un Medio de cultivo Para que los microorganismos crezcan adecuadamente, un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones: contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios disponer de ox geno temperatura adecuada humedad pH.

2 Exento de microorganismos de nutrientes en los Medios de cultivo. Un medio de cultivo para que permita el crecimiento adecuado de microorganismos debe contener como m nimo: Carbono Nitr geno Azufre F sforo Sales inorg nicas que suplan iones (K, Mg, Fe, Ca, etc.).2 Disponibilidad de nutrientes en los Medios de cultivo Estos nutrientes generalmente se aportan con Extracto de malta, Peptona, Papa, extracto de levadura, de cultivo seg n su composici n Medios Naturales. Consisten nicamente en un material Vegetal . Ejemplos: un trozo de papa. Agar jugo de manzana, Agar durazno, Agar y jugo de de cultivo seg n su composici n Medios definidos o sint ticos: son los medios que tienen una composici n qu mica definida cuali y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigaci n. Ej: Medio Czapek. Nitrato de Sodio 2 g/l Fosfato bipot sico 1 g/l Cloruro de potasio 0,5 g/l Sulfato de magnesio heptahidratado 0,5 g/l Sulfato de hierro heptahidratado 0,01 g/l Sacarosa 30 g/l Agar-agar 15 g/lMedios de cultivo seg n su composici n Medios complejos o de composici n indefinida: Son medios cuya composici n no se conoce con exactitud.

3 Contienen nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la composici n cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes. Ej: Agar Papa; Agar Malta; Medios complejos Agar Papa Dextrosa: Medio para el cultivo y conteo de levaduras y hongos en general. Agar -15g Dextrosa - 20g Infusi n papa - 4g Agua destilada 1 LMedios de cultivo seg n su estado f sico Los medios de cultivo utilizados pueden ser de diferentes tipos: Medios s lidos. Medio semis lidos. Medios l de cultivoMedios s lidos de cultivo Usualmente para preparar un medio s lido se parte de un medio l quido al que se le a ade un agente solidificante como el agar El agar es un polisac rido extra do de algas. En los medios s lidos la proporci n de Agar es siempre por encima del 15%Medios de cultivo El agar es el elemento solidificante m s empleado en la preparaci n de medios de cultivo. Sus caracter sticas principales son: Se licua completamente a temperaturas de 80 100 C y se solidifica al enfriarse a 40 grados.

4 No afecta el crecimiento de hongos ni bacterias. No es utilizado por los microorganismos que crecen en l. Medios semi-s lidos de cultivo En los medios semi-s lidos la proporci n de Agar es de alrededor del 5%Medio Agar Agua Se trata de un medio sin el agregado de nutriente alguno. Utilidad Aislamiento de hongos a partir de tejido Vegetal . Se logra que el crecimiento sea el resultado de la nutrici n que posee el tejido Vegetal . Ensayos de evaluaci n de actividad antif de cultivo En ocasiones se a aden al medio de cultivo sustancias indicadoras de actividades metab licas. Tambi n se pueden a adir sustancias que ejercen acci n inhibitoria selectiva de ciertos microorganismos. 4 Medios de cultivo La exactitud en los procedimientos de fabricaci n, preparaci n, conservaci n y uso, de los medios de cultivo asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos en los ensayos o de cultivo seg n su utilidad pr ctica Generales:Sirven para el cultivo de una gran variedad de microorganismos.

5 Ej: Agar Papa destrosado (PDA); Agar Nutriente (NA) Selectivos:Son medios a los que se les agregan sustancias para inhibir el crecimiento de otros microorganismos. Ej: Agar Malta acidificado y con antibi tico para inhibir el crecimiento de bacterias. Diferenciales:Medios de cultivo seg n su utilidad pr ctica Medios diferenciales: Son aquellos destinados a facilitar la discriminaci n de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos de cultivo seg n su utilidad pr ctica Medios selectivos: Son aquellos que favorecen por su dise o el crecimiento espec fico de un microorganismo particular o grupo de microorganismos. Es de gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una poblaci n microbiana mixtaTemperaturas de incubaci n En general los microorganismos pat genos de plantas crecen a temperaturas en el entorno de 24 a 28 C. En ocasiones incubamos a temperaturas diferentes: A 37 C cuando queremos descartar el crecimiento de agentes de control biol gico a la temperatura del cuerpo humano.

6 A 5 C o menos cuando buscamos microorganismos adaptados a crecer en la c mara frigor fica. Venturia inaequalisdebe incubarse a temperaturas de entre 16 y 20 CCondiciones adecuadas de humedad Un nivel m nimo de humedad, tanto en el medio como en la atm sfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las c lulas vegetativas de los cultivos microbianos. En las estufas de cultivo se debe proporcionar una fuente adecuada de humedad para evitar as que se deseque el de ox geno Los microorganismos aerobios necesitan que el ox geno llegue en forma adecuada al medio. En los medios l quidos se recurre a la agitaci n, de lo contrario solamente habr crecimiento en la parte de ox geno Los microorganismos aerobios necesitan que el ox geno llegue en forma adecuada al medio. Los anaerobios por el contrario crecen en ausencia de ox geno. Ej. ErwiniaPreparaci n de medio Agar Malta con antibi tico Receta del agar malta Extracto de malta 20 g/L.

7 Agar 20 g/L pH = 5,4 Sulfato de estreptomicina al 0,02% (0,1 ml de la soluci n stock/100 ml de medio).Preparaci n de medio Agar Nutriente Receta NAD (Nutriente agar destrosa) Agar nutriente 23g Destrosa 5g Agua destilada 1000 n de medio Agar Nutriente 3 g de extracto de Carne de buey 5 g de peptona tr psica de gelatina 15 g de agar de cloruro s dico y glucosa agua destilada hasta 1000 mlEsterilidad de los Medios de cultivo Los medios de cultivo han de estar perfectamente est riles para evitar otros microorganismos puedan interferir con el crecimiento del que queremos cultivar. Los medios de cultivo se esterilizan en el de cultivo En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de vidrio planas Hoy existen de pl stico. Procedimiento seguido para dispensar el medio en placas de PetriMedios de cultivo Los medios se pueden utilizar en frascos, placas de Petri o tubos.