1 Das Chromatogramm - Wiley-VCH

1 31 Das ChromatogrammDaniel Chromatographischer ProzessEine chromatographische Trennung ist dann erfolgreich, wenn es gelingt, die einzelnen Komponenten des zu trennenden Gemischs unterschiedlich schnell durch die Trennstrecke (station re Phase) wandern zu lassen. Die M glichkeiten, unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeiten der einzelnen Analyten zu rea-lisieren, lassen sich in zwei Gruppen aufteilen:1. Die Retention erfolgt durch unterschiedlich starke Sorption des Analyten an die station re Phase = unterschiedliche absolute Wanderungsgeschwindigkeit (z. B. Normalphasen-/ Umkehrphasenchromatographie, Verteilungschromato-graphie, Ionenaustauschchromatographie, Affi nit tschromatographie).2. Die por se station re Phase teilt unterschiedlich gro en Analytenteilchen unterschiedlich gro e R ume innerhalb der Trennstrecke zu, in welchen sie sich aufhalten k nnen.

2 Molek le welche so gro sind, dass sie sich nur im Zwischenkornvolumen und somit im str menden Eluenten aufhalten k nnen, wandern am schnellsten. Weil die Wanderungsgeschwindigkeit f r alle diese Teilchen ungef hr gleich gro ist, werden sie nicht getrennt. Kleinere Mole-k le k nnen durch Diffusion zus tzlich in die Poren der station ren Phase gelangen. In den Poren steht der Eluent. Die Wanderungsgeschwindigkeit der Analytenteilchen in Flussrichtung ist somit w hrend ihres Aufenthaltes im Po-renvolumen der station ren Phase gleich null. Je kleiner die Analytenmolek le sind, umso gr er ist das f r sie zug ngliche Porenvolumen und somit die Aufenthaltszeit im stehenden Eluenten. Daraus resultieren f r unterschiedlich gro e Molek le unterschiedlich lange Wanderungswege = unterschiedliche relative Wanderungsgeschwindigkeit. Gr enausschlusschromatographie ( Size Exclusion Chromatography, SEC), Gelpermeationschromatographie (GPC) und Gelfi ltrationschromatographie (GFC) sind die g ngigsten Bezeichnungen f r diese Art von richtig integrieren und bewerten: Ein Praxishandbuch f r die HPLC und GCHerausgegeben von Stavros Kromidas und Hans-Joachim KussCopyright 2008 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.

3 KGaA, WeinheimISBN: 21:16 21:16:121 Das Chromatogramm4 Die Wanderungsgeschwindigkeit der einzelnen Analyten kann durch Ver ndern verschiedener Einfl ussgr en wie Zusammensetzung der mobilen Phase, Art der station ren Phase, Temperatur etc. mehr oder weniger kontinuierlich ver ndert werden. Man kann von einer analogen1) Chromatographie sprechen. Quantifi zie-rung mittels Chromatographie erfolgt in der Regel auf diese der Chromatographie mittels Sorption k nnen die chromatographischen Bedingungen im Idealfall so gew hlt werden, dass nur eine Komponente wan-dert und die anderen Komponenten am Kopf der Trennstrecke total festgehal-ten werden resp. dass nur eine Komponente festgehalten wird und die andern Komponenten wandern. Die am S ulenkopf festgehaltenen Molek le werden anschlie end durch nderung der chromatographischen Bedingungen zum Wandern gebracht.

4 Diese, haupts chlich in der pr parativen Chromatographie angewendete, Methode wird oft als digitale1) Chromatographie Selektivit t und Effi zienz Ma f r die unterschiedliche WanderungsgeschwindigkeitIn der Chromatographie m ssen wir zwischen zwei Arten von unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten unterscheiden. Gew nscht ist, dass unterschied-liche Spezies von Molek len unterschiedlich schnell wandern. Das f hrt schluss-endlich zur Trennung der einzelnen Komponenten. Je gr er der Unterschied der Wanderungsgeschwindigkeit der unterschiedlichen Komponenten, umso besser ist die Trennung. Das System besitzt eine gute Selektivit t (s. Abb. und ).Auf der andern Seite haben auch die gleichartigen Molek le leicht unter-schiedliche Wanderungsgeschwindigkeiten. Dieser unerw nschte Unterschied in der Wanderungsgeschwindigkeit wird als Effi zienz (s. Abb. ) des chroma-Abb.

5 Unterschiedliche Arten von Molek len wandern unterschiedlich schnell. Dieser gew nschte Unterschied der Wanderungsgeschwindigkeiten wird als Selektivit t des chromatographischen Systems Auch gleichartige Molek le haben infolge von Eddy-Diffusion, L ngsdiffusion und Massenaustauschverz gerung leicht unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeiten, was zu Bandenverbreiterung f hrt (= Effi zienz des chromatographischen Systems).1) Analog und digital beziehen sich auf die Wanderungsgeschwindigkeit der 21:16 21:16:125tographischen Systems bezeichnet. Kleine Unterschiede in der Wanderungsge-schwindigkeit gleichartiger Molek le = schmale Peaks = gute Effi zienz = gro e theoretische Bodenzahl (s. Gl. ). Chromatographische Kenngr enBei analytischen Anwendungen ist der Zweck der Chromatographie, ein Chroma-togramm zu erhalten, welches uns alle gew nschten Informationen liefert [1].

6 Retentionsgr enDiese bieten uns die M glichkeit, Aussagen ber die Art einer Probekomponente zu werden Retentionszeiten verwendet; an Stelle der Retentionszeit wird oft auch das Retentionsvolumen verwendet, weil dieses vom Eluentenfl uss unabh ngig RRVtF ( )mit:VR = Retentionsvolumen, tR = Retentionszeit, F = Eluentenfl en werden im Chromatogramm immer dort bestimmt, wo die h chste Probenkonzentration gemessen wird; also bei der Totzeit (tm; t0)Unter Totzeit versteht man die Zeit, welche ein nicht-retardiertes Teilchen braucht, um die Trennstrecke zu durchqueren. W hrend dieser Zeit halten sich alle Probe-teilchen in der mobilen Phase auf. Die genaue Bestimmung der Totzeit ist nicht so einfach; f r die meisten Zwecke gen gt es, die Totzeit mit einem sog. Totzeitmar-ker zu messen (z.)

7 B. Methan in der GC resp. Nitromethan, Thioharnstoff, Uracil oder KNO3 in der LC). Genauer erh lt man die Totzeit durch Berechnung aus den Bruttoretentionszeiten von mindestens drei homologen Verbindungen, weil log k von Homologen in linearer Abh ngigkeit zu deren Molmassen steht [9]. Bruttoretentionszeit (tms; tR)Als Bruttoretentionszeit wird die durchschnittliche Zeit bezeichnet, welche ein Pro-beteilchen braucht um die Trennstrecke zu durchqueren. Die Bruttoretentionszeit setzt sich zusammen aus den Zeiten w hrend welcher sich ein Probeteilchen in der mobilen und in (an) der station ren Phase aufgehalten hat. In Chromatogrammen werden die einzelnen Peaks in der Regel mit der Bruttoretentionszeit Chromatographische Kenngr 21:16 21:16:121 Das Nettoretentionszeit (ts)Die Nettoretentionszeit sagt aus, wie lange sich eine Probekomponente in (an) der station ren Phase aufgehalten +msmsttt ( )mit:tm = Totzeit, ts = Nettoretentionszeit, tms = Retentionsfaktor oder Kapazit tsfaktor (k; k )Der Retentionsfaktor entspricht der Nettoretentionszeit, ausgedr ckt in Anzahl Totzeiten.

8 Als relative Retentionsgr e ist der k-Wert praktisch unabh ngig vom Eluentenfl uss und von den S ulendimensionen. === smsmmsmm m1tt t tktt t ( )mit:k = Retentionsfaktor, tm = Totzeit, ts = Nettoretentionszeit, tms = Peak-Ausdehnung und Basispeakbreite (wb)Die Basispeakbreite wird zwischen den Schnittpunkten der auf- und der abstei-genden Wendetangente mit der Basislinie gemessen. Bei idealen chromatogra-phischen Peaks (Gau -Peaks) befi ndet sich die Basispeakbreite in 13,4% der Peakh he und entspricht der vierfachen Standardabweichung der Normalver-teilung (s. Abb. ).Abb. Totzeit und Brutto- resp. Nettoretentionszeit von Peak Nr. 3. tm = Totzeit, ts = Nettoretentionszeit, tms = 21:16 21:16 Peakbreite in halber H he (wh)Weil es nicht ganz einfach ist, die Basispeakbreite zu bestimmen, wird oft die Peakbreite in halber H he (Halbwertsbreite) in Berechnungen eingesetzt (selbst-verst ndlich muss die Formel entsprechend korrigiert werden).

9 Peakh he (h)Die Peakh he ist die Ausdehnung des Peaks, von der Peakspitze bis zum Schnitt-punkt mit der Basislinie (senkrecht zur Zeitachse gemessen). Peaksymmetrie, Tailingfaktor (T)Der Symmetriefaktor eines Peaks sagt aus, wie gut seine Form der Idealform eines chromatographischen Peaks (Gau sche Glockenkurve) angen hert ist. Der Tailingfaktor wird in Europa meistens in 10% (manchmal auch 5% oder 15%) der Peakh he bestimmt (s. Gl. ).Abb. Die Basispeakbreite (wb) und die Peakbreite in halber H he (b0,5). Bei idealen Peaks befi ndet sich die Basispeakbreite in 13,4% der Peakh Die Peakh he wird von der Peakspitze bis zur Basislinie Chromatographische Kenngr 21:16 21:16:131 Das Chromatogramm8=bTa ( )mit:T = Symmetrie- resp. Tailingfaktor, a = Breite der aufsteigenden Peakseite (in 0,1 h), b = Breite der absteigenden Peakseite (in 0,1 h).

10 Nach USP werden die Werte in 5% der Peakh he gemessen. Die Berechnung erfolgt nach folgender Formel:+=2abTa ( )mit:T = Symmetrie- resp. Tailingfaktor, a = Breite der aufsteigenden Peakseite (in 0,05 h), b = Breite der absteigenden Peakseite (in 0,05 h).Langsames Ansteigen und schnelles Abfallen des Peaksignals nennt man Lea-ding oder Fronting. Das Umgekehrte, schneller Anstieg und langsames Abfallen, nennt man Die Peaksymmetrie wird in 10% (5%) der Peakh he gemessen, wobei a die halbe Peakbreite der aufsteigenden und b der absteigenden Peakseite Peakleading und Peaktailing. In der Praxis kommt das Peaktailing viel fter vor als das Leading. Aufgepasst: In vielen Publikationen fi ndet man Chromatogramme, bei welchen die Zeitachse von links nach rechts verl uft, weil zur Aufzeichnung des Chromatogramms z.