11. Separación de aminoácidos por cromatografía en capa ...

1 11. Separaci n de amino cidos por cromatograf a en capa fina y detecci n mediante reacci n con ninhidrina Jes s V. Jorr n Novo, M Nieves Abril D az, Jos A. B rcena Ruiz Departamento de Bioqu mica y Biolog a Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-C rdoba RESUMEN. La cromatograf a en capa fina es un caso de cromatograf a de reparto en la que los componentes de una mezcla se separan por diferencia de solubilidad entre dos sistemas disolventes. Los elementos del sistema cromatogr fico son: soporte, fase estacionaria (disolvente A), y fase m vil o eluyente (disolvente B). Es una t cnica simple en cuanto al equipamiento necesario (placa y tanque cromatogr fico) y de f cil desarrollo.

2 El par metro experimental asociado a la t cnica es el Rf (coeficiente de reparto), relacionado con la solubilidad relativa de un compuesto entre la fase estacionaria y fase m vil, y que depende de su estructura qu mica y su hidrosolubilidad/liposolubilidad. A modo de ejemplo, y dentro de la presente pr ctica, se llevar a cabo la separaci n de una mezcla de amino cidos, que se revelar n e identificar n mediante la reacci n con la ninhidrina. Palabras clave: an lisis cualitativo, biomol culas, coeficiente de reparto, reacciones coloreadas. Abreviaturas empleadas. CCF: cromatograf a en capa fina; TLC: thin layer chromatography. 1. INTRODUCCI N Y OBJETIVOS. Separaci n de mol culas por cromatograf a El estudio y caracterizaci n de las distintas biomol culas (az cares, l pidos, prote nas, cidos nucleicos, etc.)

3 Requiere en numerosos casos su aislamiento y purificaci n a partir de mezclas complejas como son los preparados de cualquier material biol gico. Una de las t cnicas bioqu micas m s cl sicas y utilizadas para dicho fin es la cromatograf a. La cromatograf a incluye una amplia gama de t cnicas, que se pueden clasificar atendiendo al fundamento f sico-qu mico en el que se basa la separaci n (cromatograf a de adsorci n, de reparto, de cambio i nico, de filtraci n molecular, hidrof bica y de afinidad), o al material sobre el que se lleva a cabo (cromatograf a en papel, capa fina, en columna y de gases). Todas las t cnicas intentan explotar las diferencias f sicas, qu micas y biol gicas de las distintas biomol culas para llevar a cabo su separaci n y aislamiento.

4 Entre dichas propiedades podr amos citar: i) Diferencias en solubilidad en diferentes solventes, tanto org nicos como acuosos. ii) Diferencias en tama o y forma. iii) Diferencias en carga. iv) Diferencias en afinidad por otras biomol culas. Todas estas propiedades y, por tanto, la separaci n de diferentes compuestos est n influenciadas por las condiciones del medio de separaci n, pH, temperatura, fuerza i nica e hidrofobicidad. De forma general, en las t cnicas cromatogr ficas existe una distribuci n de las mol culas entre dos fases, la fase estacionaria o parte del sistema separador que permanece fija en el espacio, y la fase m vil que circula sobre la fase estacionaria en ntimo contacto con sta.

5 Cromatograf a de reparto En la presente pr ctica llevaremos a cabo una cromatograf a de reparto, en capa fina, para la separaci n de amino cidos. En la cromatograf a de reparto los componentes de una mezcla se separan en base a una distribuci n diferente entre la fase m vil y la fase estacionaria. El movimiento relativo de las mol culas a lo largo del sistema cromatogr fico es el resultado de un equilibrio entre las fuerzas de transmisi n o arrastre ejercido por la fase m vil en su desplazamiento sobre la fase estacionaria y las fuerzas que tienden a frenar dicho desplazamiento. Las fuerzas de frenado pueden ser tanto de reparto (basado en criterios de solubilidad) como de adsorci n. La teor a de la cromatograf a de reparto se basa en que, en general, si dos fases inmiscibles se encuentran en contacto una con otra y si una de las dos fases contiene un soluto, ste se distribuir entre ambas de acuerdo con sus solubilidades relativas.

6 Dicho fen meno se denomina reparto y viene determinado por el coeficiente de reparto, que es la relaci n entre las concentraciones del soluto, en el equilibrio, en las dos fases. En la cromatograf a de reparto tenemos un soporte inerte al que est unida la fase estacionaria l quida. La mezcla a separar junto con la fase m vil se hace avanzar a lo largo de la fase estacionaria por capilaridad. En dicho avance, la fase m vil arrastrar . consigo un porcentaje de mol culas de cada componente a separar de acuerdo con los respectivos coeficientes de reparto. La distancia recorrida por cada uno de los componentes de la muestra depender de la cantidad de solvente o eluyente que se haga pasar y de los coeficientes de reparto, de manera que si stos son diferentes aqu lla tambi n lo ser , siendo posible la separaci n si se utiliza el volumen de eluyente apropiado.

7 En su desplazamiento, las mol culas de soluto se distribuir n no puntualmente, sino formando un rea debido a que son parcialmente solubles en las dos fases y a otros fen menos tales como la difusi n. En la cromatograf a de reparto se suelen utilizar diversos materiales como soportes: almid n, celulosa, gel de s lice, xido de aluminio, etc. Aunque en 2. teor a se consideran inertes, pueden generar diferentes procesos de adsorci n, por lo que la separaci n ocurrir tambi n, en parte, debido a la interacci n entre las mol culas a separar con dicho soporte, la cual actuar a como fuerza de frenado. La fase estacionaria se forma suspendiendo o embebiendo el soporte con el solvente adecuado; ste recubre las part culas del soporte y es retenido por adsorci n y/o capilaridad.

8 El espacio entre las part culas del soporte ser . utilizado por la fase m vil para su desplazamiento. Debemos de tener en cuenta que como fase m vil se suelen utilizar solventes hidr fobos cuando haya que separar compuestos no polares y solventes acuosos cuando haya que separar sustancias polares. Por su parte, la fase estacionaria, que debe ser al menos parcialmente inmiscible con la m vil, suele ser por lo general hidrof lica, aunque tambi n pueden utilizarse compuestos hidr fobos. Cromatograf a en capa fina En la cromatograf a en capa fina, CCF o TLC ("thin-layer chromatography, en la terminolog a inglesa) se puede utilizar como soporte cualquier sustancia que pueda dividirse en part culas finas y distribuirse uniformemente en forma de l minas.

9 Esto incluye sustancias inorg nicas (gel de s lice, xido de aluminio, tierra de diatomeas, silicato de magnesio, etc) y org nicas (celulosa, poliamida, polietileno, etc). La utilizaci n de soportes hidr fobos facilita la separaci n de compuestos no polares (l pidos, por ejemplo). En la CCF, la fase estacionaria es una l mina de 0,25-0,50 mm de espesor, extendida de forma uniforme sobre la superficie de una placa de vidrio o pl stico. Aunque muchas casas comerciales suministran placas ya preparadas, stas pueden hacerse en el laboratorio con aparatos especiales que permiten extender sobre la placa de vidrio o pl stico la papilla formada por la suspensi n del material en un disolvente adecuado (generalmente agua).

10 La placa ha de dejarse secar antes de su utilizaci n. Para el desarrollo de la cromatograf a, las muestras, en un disolvente adecuado, se aplican puntualmente con la ayuda de jeringas, micropipetas o capilares en un extremo de la placa. El volumen de muestra a aplicar es cr tico, ya que va a afectar a la resoluci n (separaci n de los componentes de una mezcla compleja), y depende de la concentraci n del compuesto o compuestos de inter s en la muestra. Para soluciones concentradas bastar una cantidad muy peque a (rango de l) para aplicar suficiente cantidad de los solutos a separar sin llegar a saturar la capacidad de resoluci n de la placa cromatogr fica. Para soluciones muy diluidas, deber aplicarse un volumen suficiente (de hasta varios ml) para asegurar una cantidad detectable de soluto o solutos de inter s.