Analyse d’échantillons alimentaires pour la présence d ...

1 Analyse d' chantillons alimentaires pour la pr sence d'organismes g n tiquement modifi s Module 4. Extraction et purification de l'ADN. M. Somma WORLD HEALTH ORGANIZATION ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE. REGIONAL OFFICE FOR EUROPE BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE. WELTGESUNDHEITSORGANISATION ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ. REGIONALB RO F R EUROPA ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО. Extraction et purification de l'ADN 2. Table des mati res Module 4. Extraction et purification d'ADN. INTRODUCTION 3. METHODES D'EXTRACTION 4. METHODES DE PURIFICATION 4. METHODE D'EXTRACTION ET DE PURIFICATION AU CTAB 6. QUANTIFICATION DE L'ADN PAR SPECTROPHOTOMETRIE 9. PRINCIPES DE LA DETERMINATION SPECTROPHOTOMETRIQUE DE L'ADN 10. DETERMINATION DE LA CONCENTRATION EN ACIDES NUCLEIQUES 11.

2 EXPERIENCE 14. REFERENCES 18. Analyse d' chantillons alimentaires pour la pr sence d'organismes g n tiquement modifi s Module 4. Extraction et purification de l'ADN 3. Introduction L'extraction et la purification des acides nucl iques sont les premi res tapes dans la plupart des tudes de biologie mol culaire et dans toutes les techniques d'ADN. recombinant. L'objectif des m thodes d'extraction des acides nucl iques dans le cas pr sent est d'obtenir des acides nucl iques purifi s, tir s de sources diverses, afin de pouvoir mener une Analyse sp cifique de d tection d'OGM en utilisant la r action de polym risation en cha ne (PCR). La qualit et la puret des acides nucl iques comptent parmi les facteurs les plus critiques pour l' Analyse PCR.

3 Afin d'obtenir des acides nucl iques hautement purifi s exempts de tout contaminant visibles, des m thodes d'extraction ad quates devraient tre appliqu es. Les contaminants susceptibles d'inhiber la r action PCR sont num r s dans le Tableau 1. Afin d' viter un r sultat faux-n gatif du fait de la pr sence d'inhibiteurs de PCR dans l' chantillon, il est vivement recommand de r aliser une exp rience de contr le visant tester l'inhibition de la PCR. On recourt g n ralement cette fin une Analyse PCR sp cifique pour les v g taux (eucaryotes ou chloroplastes) ou sp cifique l'esp ce. Tableau 1. Quelques inhibiteurs de la PCR. Inhibiteur Concentration inhibitrice SDS > 0,005%. Ph nol > 0,2%. thanol > 1%. Isopropanol > 1%. Ac tate de sodium > 5 mM.

4 Chlorure de sodium > 25 mM. EDTA > 0,5 mM. H moglobine > 1 mg/ml H parine > 0,15 Ur e > 20 mM. M lange de r actifs > 15%. Vu qu'il existe une grande diversit de m thodes d'extraction et de purification des acides nucl iques, le choix de la technique la plus ad quate repose g n ralement sur les crit res suivants : L'acide nucl ique cible, L'organisme source, Le mat riel de d part (tissu, feuille, graine, mat riel transform , etc.), Les r sultats escompt s (rendement, puret , temps de purification requis, etc.), Analyse d' chantillons alimentaires pour la pr sence d'organismes g n tiquement modifi s Module 4. Extraction et purification de l'ADN 4. L'application en aval (PCR, clonage, tiquetage, transfert d'ADN, RT-PCR, synth se d'ADNc, etc.)

5 Les principes de certaines des m thodologies les plus utilis es aujourd'hui pour extraire et purifier des acides nucl iques sont d crits dans les sections suivantes. M thodes d'extraction L'extraction d'acides nucl iques d'un mat riau biologique requiert la lyse cellulaire, l'inactivation des nucl ases cellulaires et la s paration de l'acide nucl ique souhait . de d bris cellulaires. La proc dure de lyse id ale est souvent un compromis de techniques et doit tre suffisamment rigoureuse pour briser le mat riau de d part complexe (par exemple, le tissu), mais suffisamment douce pour pr server l'acide nucl ique cible. Les proc dures de lyse courantes sont les suivantes : le rupture m canique (ex. : broyage ou lyse hypotonique), le traitement chimique (ex.)

6 : lyse d tergente, agents chaotropiques, r duction des thiols). et la digestion enzymatique (ex.: prot inase K). La rupture de la membrane et l'inactivation des nucl ases intracellulaires peuvent tre combin es. titre d'exemple, une solution simple peut contenir des d tergents pour solubiliser les membranes cellulaires et des sels chaotropiques puissants pour inactiver les enzymes intracellulaires. Apr s la lyse cellulaire et l'inactivation du nucl ase, les d bris cellulaires peuvent tre ais ment retir s par filtrage ou par pr cipitation. M thodes de purification Les m thodes de purification des acides nucl iques issus d'extraits cellulaires sont g n ralement des combinaisons de deux ou plusieurs des techniques suivantes : extraction/pr cipitation, chromatographie, centrifugation et s paration par affinit.

7 Une br ve description de ces techniques sera donn e dans les paragraphes suivants (Zimmermann et al., 1998). Analyse d' chantillons alimentaires pour la pr sence d'organismes g n tiquement modifi s Module 4. Extraction et purification de l'ADN 5. Extraction/Pr cipitation L'extraction par solvants est souvent utilis e pour liminer les contaminants d'acides nucl iques. titre d'exemple, une combinaison de ph nol et de chloroforme sert fr quemment supprimer les prot ines. La pr cipitation par l'isopropanol ou l' thanol est g n ralement utilis e pour concentrer les acides nucl iques. Si la quantit . d'acides nucl iques cibles est faible, un v hicule inerte (tel que le glycog ne) peut tre ajout au m lange afin d'accro tre l'efficacit de la pr cipitation.

8 D'autres m thodes de pr cipitation des acides nucl iques incluent la pr cipitation s lective . l'aide de fortes concentrations de sel ( relargage ) ou la pr cipitation de prot ines en utilisant les changements au niveau du pH. Chromatographie Les m thodes chromatographiques peuvent utiliser diff rentes techniques de s paration, telles que la filtration sur gel, l' change d'ions, l'adsorption s lective ou la liaison par affinit . La filtration sur gel exploite les propri t s du tamisage mol culaire de particules de gel poreuses. Une matrice avec des pores d'une taille d finie permet aux petites mol cules de traverser les pores par diffusion, tandis que les plus grosses mol cules sont exclues et lu es. Les mol cules sont donc lu es afin de diminuer la taille mol culaire.

9 La chromatographie par change d'ions est une autre technique qui a recours l'interaction lectrostatique entre une mol cule cible et un groupe fonctionnel sur la matrice colonne. Les acides nucl iques (polyanions lin aires forte charge n gative) peuvent tre lu s des colonnes d' change d'ions gr ce de simples tampons de sel. Dans la chromatographie par adsorption, les acides nucl iques sont fix s s lectivement par adsorption sur des silices ou du verre en pr sence de certains sels (ex. : des sels chaotropiques), alors que d'autres mol cules biologiques ne se fixent pas. Un tampon ou une eau faible en sels peut ensuite luer les acides nucl iques et produire ainsi un chantillon utiliser directement dans des applications en aval.

10 Centrifugation La centrifugation s lective est une m thode de purification puissante. titre d'exemple, l'ultracentrifugation isopycnique en gradients de CsCl des forces g lev es a t longtemps utilis e pour la purification de plasmides. La centrifugation est souvent combin e une autre m thode. Un exemple d'une telle utilisation est la chromatographie colonne rotative qui combine la filtration sur gel et la centrifugation afin de d barrasser l'ADN ou l'ARN des contaminants de plus petit Analyse d' chantillons alimentaires pour la pr sence d'organismes g n tiquement modifi s Module 4. Extraction et purification de l'ADN 6. format (sels, nucl otides, etc.), pour l' change de tampon ou pour la s lection de taille. Certaines proc dures combinent l'adsorption s lective sur matrice chromatographique (cf.)