COCOS GRAM POSITIVOS: Aspectos prácticos

1 1 COCOS gram POSITIVOS: Aspectos pr cticosVer nica SeijaTAXONOMIA - Breve rese aAntes de entrar de lleno en la identificaci n del g neroStaphylococcus realizaremos una breve introducci n ala taxonom a de los COCOS gram se pueden clasificar, en primera instancia, encuanto a sus requerimientos atmosf ricos. As tenemoslos COCOS gram positivos anaerobios estrictosconstituidos por los g neros Peptococcus yPeptoestreptococcus, los cuales ser n estudiados en elcap tulo referido a bacterias otro lado tenemos los COCOS gram positivos aerobiosy anaerobios facultativos que est n constituidos por lafamilia Micrococacceae (g neros Staphylococcus,Micrococcus, Planococcus y Stomacoccus) y losg neros Streptococcus y STAPHYLOCOCCUSIDENTIFICACIOND urante el curso se le entregar n a los estudiantesdistintas cepas de COCOS gram + para su identificaci primer paso para la identificaci n de una especiebacteriana es el estudio de su morfolog a microsc pica ymacrosc pica.

2 Luego se deben estudiar susrequerimientos atmosf ricos y nutricionales. Por ltimose procede a la realizaci n de pruebas bioqu micas quepermitir n llegar a la identificaci n de g nero y a microsc picaPara la misma se debe realizar un frotis, de preferencia apartir de medio l quido, realizando luego la tinci n deGram lo que nos permitir apreciar la forma, agrupaci ny comportamiento al gram de la cepa en estudio. Elg nero Staphylococcus se caracteriza por ser cocosGram positivos que se agrupan en forma de a macrosc picaExiste morfolog a macrosc pica en medio l quido y enmedio s lido. En medio l quido debemos observar laturbidez que se desarrolla luego de incubar 18-24 medio s lido debemos contar con un aislamiento dela cepa a estudiar en una placa de Petri. El aislamientonos permitir observar las caracter sticas de las colonias,que son las estructuras macrosc picas que forman lasbacterias cuando crecen en medios s atmosf ricosEl g nero Staphylococcus es aerobio-anaerobiofacultativo, por tanto su crecimiento en tioglicolato ser en toda la extensi n del nutricionalesEl g nero Staphylococcus es no exigente en cuanto a susrequerimientos nutricionales, por lo tanto crece enmedios de cultivo BIOQUIMICOSLas pruebas o ensayos bioqu micos son aquellas queponen en evidencia la existencia de una enzima o pasosmetab licos enumeraremos las pruebas bioqu micas necesariaspara la identificaci n de los PRUEBA DE LA CATALASAO bjetivo: Separar la Flia.

3 Micrococacceae (catalasa +)de los G neros Streptococcus y Enterococcus (catalasa-).Fundamento: La enzima catalasa descompone elper xido de hidr geno (H2O2) en agua y ox geno bajo laf rmula 2 H2O2----2 H2O + O2. De esta manera lasbacterias se protegen del efecto t xico del H2O2, que esun producto final del metabolismo aerobio de losaz : Se coloca una gota de H2O2 al 3% sobreun portaobjetos y luego se transfiere una porci n decolonia sobre el H2O2 realiz ndose una emulsi n. En loposible debe tomarse la colonia a partir de un medio sinsangre ya que los eritrocitos tienen actividad de catalasay pueden falsear los prueba tambi n puede realizarse en un aislamientoen tubo, simplemente colocando unas gotas de H2O2dentro del n de resultados: El desprendimiento deburbujas se considera una prueba de la Flia. Micrococacceae existen 4 g neros, elde mayor importancia cl nica es el G neroStaphylococcus.

4 Para diferenciarlo del G neroMicrococcus se realizan distintas pruebas bioqu micasque s lo mencionaremos en la Tabla N del existen 3 especies deimportancia cl nica: , Estas se diferencias seg n las pruebasbioqu micas que se detallan en la Tabla N PRUEBA DE LA COAGULASAO bjetivo: Permite separar , que poseecoagulasa, de las otras especies de estafilococos quegen ricamente se denominan coagulasa : posee dos tipos de endocoagulasa o coagulasa ligada o"clumping factor" que est unida a la pared celular. Estaact a directamente sobre el fibrin geno provocando laformaci n de co gulos o grumos cuando se mezcla unasuspensi n bacteriana con plasma citratado (test enl mina).2 Tabla N 2 CARACTERES G. STAPHYLOCOCCUS G. MICROCOCCUS Bacitracina (disco U)positivonegativo Lisostafinasensibleresistente Utilizaci n de glucosa anaerobiapositivanegativaTabla N 3 CARACTERES S.

5 Aureus S. saprophyticus S. epidermidisCOAGULASA+--DNAsa+--NUCLEASAT ERMOESTABLE+- -PRESENCIA DE PROTEINA A+--SUSCEPTIBILIDAD A LANOVOBIOCINARR exocoagulasa o coagulasa libre que act amediante la activaci n de un factor (CRF), form ndoseun complejo coagulasa-CRF, el cual reacciona con elfibrin geno produci ndose un co gulo de fibrina (test entubo).Test en l minaProcedimiento: Se emulsionan una o m s colonias enuna gota de suero fisiol gico hasta formar unasuspensi n lechosa sobre un portaobjetos. Luego seagrega una gota de plasma citratado de conejo y n de resultados: Debe realizarse dentro delos primeros diez segundos. Un test positivo se evidenciapor la formaci n de grumos. Los test negativos deben serconfirmados por test en en tubo3 Procedimiento: Se emulsionan varias colonias en untubo con 0,5ml de plasma citratado de conejo. Se incubaa 35 y se chequea la formaci n del co gulo a las 4horas.

6 Si es negativo se reincuba toda la noche y seprocede a su lectura a las 18 horas. La lectura a las 4horas, es fundamental porque en alguna oportunidadpuede suceder que las fibrinolisinas de lisen elco gulo luego de 18 horas de incubaci n y de estamanera se produzcan un test falso n de resultados: Se observa la formaci nde un co gulo total o parcial si el test es DE DESOXIRRIBONUCLEASA(DNAsa)Objetivo: Permite diferenciar que es la nicaespecie dentro del G nero Staphylococcus que poseeDNAsa de las otras : Se basa en la presencia de la enzimatermoestable DNAsa que es capaz de clivar los enlacesfosfodiester internos de la mol cula de DNA. Se utilizaun medio s lido que contiene verde de metilo el cual secombina con DNA altamente polimerizado. Cuan-do lacombinaci n no ocurre, por acci n de la enzima DNAsa,se produce una decoloraci n del : Se siembra una colonia de estafilococoen forma de moneda en una placa de medio s lido quecontiene DNA y verde de metilo.

7 Se incuba 18 horas a35 .Interpretaci n de resultados: La formaci n de un halotransparente alrededor de la siembra indica presencia SUSCEPTIBILIDAD A LA NOVOBIOCINAO bjetivo: Separar (resistente a lanovobiocina) de los dem s estafilococos : Varias especies del G neroStaphylococcus son resistentes a la novobiocina (discode 5 g).Procedimiento: Se siembra una placa de agar sangre conun hisopo embebido en una suspensi n de la cepa aestudiar. Luego se aplica el disco de novobiocina y seincuba a 35 por 18 n de resultados: Un halo de inhibici n decrecimiento menor o igual a 16mm corresponde Un halo de inhibici n mayor de 16mmcorresponde a otros estafilococos coagulasa STREPTOCOCCUSComo ya mencionamos para el G nero Staphylococcusla identificaci n comienza con el estudio de lamorfolog a macrosc pica y microsc pica, la cual ya fuecomentada en el cap tulo te rico este cap tulo pr ctico s lo estudiaremos aquellasespecies m s frecuentes en la pr ctica cl nica, las cualesser n entregadas a los estudiantes para su identificaci cuanto a los requerimientos nutricionales el G neroStreptococcus es exigente y por lo tanto debe sercultivado en medios ricos que le aporten los nutrientesnecesarios, por ejemplo, agar sangre de las pruebas bioqu micas para la identificaci n,la primera, luego de determinar que se trata de un cocoGram positivo, es la prueba de la catalasa.

8 La misma yafue comentada en el cap tulo de de determinar que se trata de un coco Grampositivo catalasa negativo, debemos proceder a observarel efecto que tiene la cepa sobre el agar sangre(hem lisis). As podemos clasificar este grupo deg rmenes en: hemol ticos: son aquellos que producen una hem lisistotal de los gl bulos rojos, observ ndose como un halotransparente alrededor de las colonias. hemol ticos: son aquellos que producen hem lisisparcial, la cual se observa como un halo con tonalidadverdosa alrededor de las hemol ticos: son aquellos que no producenhem lisis sobre el agar HEMOLITICOSLos grupos m s importantes son aquellos que semencionan en la Tabla N 1, junto a las pruebasbioqu micas que se utilizan para su diagn sticopresuntivo. Siempre se requieren pruebas deconfirmaci n serol gica posterior para realizar undiagn stico definitivo.

9 Str. grupo D es incluido dentrode los -hemol ticos, ya que existen cepas de que pueden ser -hemol A LA BACITRACINAO bjetivo: Separar el Streptococcus pyogenes de losdem s estreptococos beta hemol : Streptococcus pyogenes es sensible abajas concentraciones de Bacitracina (discosconteniendo 0,04U). Tambi n existe un 5% de cepas deStr. agalactiae que son sensibles a la : Se realiza sembrando un gran in culo,tomado con asa bacteriol gica de un cultivo puro, que seestr a sobre una placa de agar sangre en variasdirecciones intentando obtener un cultivo se coloca el disco de Bacitracina y se incuba 18-24 horas a 37 .Interpretaci n de resultados: La aparici n de cualquierdi metro de halo de inhibici n de crecimiento alrededordel disco se considera prueba HIDROLISIS DEL PYRO bjetivo: Separar Streptococcus pyogenes yEnterococcus de los de-m s y Enterococcus poseen la capacidad dehidrolizar el substrato PYR (pirridonil -naftilamida)debido a que poseen la enzima l-piroglutamilaminopeptidasa.

10 Existen varias configuracionescomerciales de este test por eso no detallaremos ningunaen particular. En general siempre se revelan por uncambio de color. Este test es m s espec fico y menoslaborioso que realizar el test de sensibilidad a laBacitracina y la bilis esculina y caldo salado (se ver nm s adelante).3. PRUEBA DE CAMPO bjetivo: Separar de los dem sestreptococos -hemol : Se basa en que los estreptococos delgrupo B producen un factor llamado CAMP (factor demonofosfato de adenina c clica) que aumenta la zona dehem lisis producida por un estafilococo productor de : Se realiza estriando un cultivo deestreptococo -hemol tico en forma perpendicular a unaestr a de un estafilococo productor de -lisina en agarsangre. Se incuba 18-24 horas a 37 n de los resultados: La prueba positiva seevidencia por la presencia de una zona de potenciaci nde la hem lisis en forma de puntas de flecha en el lugardonde se contactan las dos estr ALFA Y GAMMAHEMOLITICOSA lgunos grupos, como el D, ya fueron mencionados enla Tabla 3.