CONCEPTOS FUNDAMENTALES DE CROMATOGRAFÍA

1 CONCEPTOS FUNDAMENTALES DECROMATOGRAF A1 INTRODUCCI NEn 1910, el bot nico ruso M. Tswett describi por vez primera esta t cnica, que fue aplicadaa la separaci n de pigmentos de plantas, d ndole el nombre de cromatograf a en referencia a lasbandas coloreadas de pigmentos que se separaban por su adsorci n selectiva sobre columnas de su descubrimiento, la cromatograf a quedo pr cticamente olvidada hasta 1930 a o en que fueredescubierta por Kuhn y Lederer, quienes la aplicaron para la separaci n de carotenoides; a partirde este momento, el uso de esta t cnica se fue extendiendo cada vez m s, al tiempo que sedesarrollaban diferentes versiones de la misma: cromatograf a de reparto (Martin y Synge, 1941),de papel (Consden, Gordon y Martin, 1944), de capa fina (Stahl, 1958), etc.

2 Un hito importante enel desarrollo de la cromatograf a lo constituy el desarrollo de la cromatograf a gas-l quido (Martiny James, 1952), t cnica que encontr r pidamente aplicaciones de gran importancia, lo que llevo asu vez al desarrollo de la teor a de la separaci n cromatogr fica (Van Deemter, 1956; Giddings,1965, etc.) as como al desarrollo de una instrumentaci n que permit a un mayor control de lascondiciones de en d a casi no hay campo de la qu mica, biolog a, medicina, etc. en el que no se utilicela cromatograf a en alguna de sus formas, tanto en su vertiente preparativa como en la anal tica; porotra parte el desarrollo sobre el uso conjunto de la cromatograf a con otras t cnicas anal ticas, as como el desarrollo de otros tipos de cromatograf a, como es por ejemplo la de fluidos supercr ticos,hace previsible una extensi n a n mayor de su B SICOSLa cromatograf a es esencialmente un m todo f sico de separaci n en el que los componentesa separar se distribuyen entre dos fases, una inm vil (lecho estacionario), y otra m vil (fase m vil)la cual percola a trav s de la primera.

3 El proceso cromatogr fico se da como resultado de repetidosprocesos de sorci n-desorci n durante el movimiento de los componentes de la mezcla arrastradospor la fase m vil a lo largo del lecho estacionario (eluci n), produci ndose la separaci n debido alas diferencias en las constantes de distribuci n de los componentes de la mezcla entre la faseestacionaria y la m vil. A la distribuci n final de los componentes en funci n de su posici n sobreel lecho estacionario, o del tiempo en que eluyen se le denomina cticamente no existen restricciones sobre la naturaleza de las fases a utilizar, siempre quela fase estacionaria sea s lida o l quida y la fase m vil l quida o gaseosa, por lo que es posible, enprincipio, realizar por medio de estas t cnicas la separaci n de los componentes de cualquier otra parte, la utilizaci n de las t cnicas cromatogr ficas no esta exenta de dificultades, debidofundamentalmente a la gran cantidad de par metros que pueden influir en el proceso de separaci n.

4 Lo cual dificulta la elecci n de las condiciones ptimas de separaci n y en muchas ocasiones implicala irreproducibilidad de los resultados. Por ello la cromatograf a no es una t cnica de rutina quepueda aplicarse sin m s a cualquier mezcla, sin invertir en muchos casos gran cantidad de esfuerzoy de cromatograf aLas t cnicas cromatogr ficas pueden clasificarse en funci n del mecanismo de separaci nde los componentes entre las fases, o bien por la forma de operar del ) Mecanismos de separaci nEn funci n del mecanismo de separaci n, las t cnicas de cromatograf a pueden clasificarse3en:- Cromatograf a de adsorci n. La separaci n depende de los equilibrios de adsorci n-desorci n de los componentes de la mezcla, entre la fase estacionaria s lida y la fase m vill quida o gaseosa.

5 La fuerza con que es adsorbido un componente depende de la polaridadde este, de la actividad del adsorbente y de la polaridad de la fase m vil. En general cuantom s polar es un compuesto m s f cilmente ser adsorbido. El orden general de eluci n dealgunos compuestos org nicos, de la actividad de algunos adsorbentes y de la fuerza deeluci n de algunos disolventes comunes, se recogen en la Tabla I. La cromatograf a deadsorci n, es una t cnica que est particularmente bien adaptada para la separaci n decompuestos de polaridad baja y media. La separaci n de compuestos muy polares mediantecromatograf a de adsorci n requiere, debido a la gran retenci n que ofrecen, la utilizaci nde adsorbentes muy poco activos, o bien, tratamientos qu micos previos para la preparaci nde la muestra (preparaci n de trimetilsilil derivados, etc.)

6 A fin de reducir su Cromatograf a de reparto. Est basada en la separaci n de una mezcla de substanciasmediante el reparto existente entre la fase m vil (l quido o gas) y la fase estacionaria(l quida) soportada o ligada sobre un s lido adecuado. La mayor o menor migraci n de uncompuesto en este tipo de cromatograf a, ser funci n del coeficiente de reparto de ste entrela fase estacionaria y la fase m vil:La cromatograf a de reparto es utilizable para la separaci n de mezclas de compuestos depolaridad media y alta. Ejemplos de este tipo de cromatograf a, son las cromatograf as sobrepapel, s lice hidratada y la cromatograf a l qida de alta eficacia en fase Cromatograf a por tama o molecular, tambi n llamada de permeaci n de gel o de tamizmolecular.

7 Consiste en la separaci n de las mol culas bas ndose en su tama o en lugar de4en su solubilidad o polaridad. Las fases estacionarias empleadas para este tipo decromatograf a son inorg nicas (zeolitas), o geles org nicos compatibles con disolventesacuosos (agarosa, poliacrilamida) u org nicos (copol meros estireno/divinilbenceno). Estasfases estacionarias poseen cavidades en las cuales las mol culas de los compuestos a separarpueden penetrar y ser retenidas, siendo las mol culas mayores las eluidas de la columna enprimer lugar; el rango de trabajo de estas fases estacionarias, se define como el intervalo depesos moleculares que pueden ser separados; otro par metro que caracteriza a este tipo defases, es su l mite de exclusi n, que se define como el peso molecular a partir del cual loscompuestos pasar n a trav s del lecho estacionario sin experimentar retenci Cromatograf a de cambio i nico.

8 Las separaciones por intercambio i nico, se llevan a cabocon materiales insolubles y de textura porosa, los cuales presentan grupos reactivos asociadosa iones l biles capaces de intercambiarse con los del medio que les rodea, por lo queinevitablemente este tipo de cromatograf a ha de realizarse en medio l quido. Lacromatograf a de intercambio i nico, es utilizable para la separaci n de substancias i nicas,tanto inorg nicas como org nicas. Las separaciones por cambio i nico, est n basadas en losdiferentes equilibrios de reparto de los iones de la mezcla entre el material cambiador y ladisoluci n:En general, se utilizan tres tipos de materiales para cromatograf a de cambio i nico: resinas,geles y celulosas.

9 La diferencia fundamental entre ellos reside en su microestructura ya que,generalmente, las resinas presentan un tama o de poro mucho menor, siendo apropiadas parala separaci n de substancias de peque o volumen molar. Otras diferencias existentes entrelos diversos materiales de cambio i nico son debidas a la naturaleza de los gruposcambiadores (fuerza del grupo cambiador) y al n mero de estos por unidad de peso dematerial (capacidad de cambio).Debe tenerse en cuenta que los mecanismos de separaci n descritos, son aproximaciones a5las situaciones reales y que, aunque en una t cnica concreta predomine alguno de ellos, la separaci nsuele estar basada en la conjunci n de diversos Adsorbentes y disolventes m s comunes en cromatograf de eluci n, actividad de adsorbentes y fuerza de eluci n de los disolventesSecuenciaOrden de eluci n decompuestosActividad deadsorbentesFuerza de eluci n dedisolventes-+Hidrocarburos saturadosCelulosaEter de petr leoHidrocarburos arom ticosCiclohexanoDerivados halogenadosEteresBencenoTetracloruro de carbonoSulfato c lcico (yeso)

10 DiclorometanoCetonasS liceCloroformoAldeh dosFlorisilEter diet licoEsteresOxido de magnesioAcetato de etiloAlcoholesAminasAl minaAcidosCarb n activoAcetonan-propanolEtanolMetanolAgua Acido ac tico6b) Formas de separaci posible clasificaci n de las t cnicas cromatogr ficas, est basada en la forma de operardel sistema cromatogr fico. B sicamente existen cuatro formas de operaci n:- An lisis por desarrollo. Es el m todo utilizado en los experimentos iniciales decromatograf a. El cromatograma se desarrolla hasta que el frente de disolventealcanza el final del lecho estacionario, de forma que los constituyentes de la mezclauna vez separados permanecen sobre el lecho al finalizar la separaci n.