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CONTEGGIO DELLE COLONIE SU AGAR A 22 °C E 37 °C

Rapporti ISTISAN 05/xx 1 CONTEGGIO DELLE COLONIE SU AGAR A 22 C E 37 C 0. Generalit e definizioni Il CONTEGGIO DELLE COLONIE su agar un parametro che permette di rilevare un gruppo eterogeneo di microrganismi aerobi che hanno differenti capacit metaboliche e richieste nutrizionali. L uso di temperature diverse permette di mettere in evidenza microrganismi mesofili (a 37 C) e psicrofili (a 22 C). Molti di essi possono appartenere alla microflora ambientale autoctona DELLE acque , presente indipendentemente da qualsiasi contaminazione.

Rapporti ISTISAN 05/xx 2 Direttiva Europea 98/83/CE sulle acque destinate al consumo umano e recepito nel conseguente D.Lgs. n. 31 del 2001. 3. Strumentazione e vetreria

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1 Rapporti ISTISAN 05/xx 1 CONTEGGIO DELLE COLONIE SU AGAR A 22 C E 37 C 0. Generalit e definizioni Il CONTEGGIO DELLE COLONIE su agar un parametro che permette di rilevare un gruppo eterogeneo di microrganismi aerobi che hanno differenti capacit metaboliche e richieste nutrizionali. L uso di temperature diverse permette di mettere in evidenza microrganismi mesofili (a 37 C) e psicrofili (a 22 C). Molti di essi possono appartenere alla microflora ambientale autoctona DELLE acque , presente indipendentemente da qualsiasi contaminazione.

2 Negli ultimi anni, il ruolo svolto nelle acque destinate al consumo umano dal gruppo di microrganismi indicati dagli anglosassoni sotto il nome di Heterotrophic Plate Count (HPC) ( CONTEGGIO degli eterotrofi) e corrispondente al termine CONTEGGIO DELLE COLONIE su agar, stato approfondito e riconsiderato. L Organizzazione Mondiale della Sanit ha riconosciuto che gran parte degli studi epidemiologici pi recenti, volti alla verifica del rischio associato alla presenza di questi microrganismi nelle acque , ha confermato che non esistono evidenze che dimostrino che, in assenza di contaminazione fecale, i risultati ottenuti dalla determinazione dell HPC siano correlati con i rischi per la salute nella popolazione sana.

3 Inoltre, stato pi volte sottolineato che i metodi analitici utilizzati per la determinazione del parametro si limitano a rilevare microrganismi vitali e non sono in grado di evidenziare patogeni eventualmente presenti nell acqua. Nella Direttiva Europea 98/83/CE sulle acque destinate al consumo umano e nel conseguente n. 31 del 2001, il parametro riportato nella Parte A e nella Parte C (parametri indicatori) dell Allegato I. Se per le acque imbottigliate (Parte A) sono stabiliti valori di parametro ( CONTEGGIO a 22 C: 100/mL; CONTEGGIO a 37 C: 20/mL), alla concentrazione degli eterotrofi rilevabili nelle acque in distribuzione (Parte C) non stato assegnato alcun valore limite.

4 La normativa stabilisce infatti che i valori del CONTEGGIO DELLE COLONIE a 22 C nelle acque in rete debbano presentarsi senza variazioni anomale , accettando quindi la possibilit che ogni tipo di acqua abbia comunque proprie caratteristiche di qualit e una flora microbica naturale. Tuttavia, il superamento DELLE concentrazioni storicamente rilevate nell acqua in distribuzione pu segnalare la potenziale esistenza di condizioni di ricrescita batterica in rete e modifiche della qualit dell acqua. Il parametro va considerato indicatore di qualit e di efficienza di trattamento.

5 Variazioni di concentrazione sono tollerate fermo restando quanto stabilito nell art. 14 del decreto e possono, in questo caso, essere segnalate come inosservanza del valore di parametro. 1. Campo di applicazione La procedura analitica viene utilizzata per il rilevamento, nelle acque sorgive, sotterranee e superficiali, destinate o da destinare al consumo umano e nelle acque ad uso ricreativo (piscine), di microrganismi aerobi coltivabili a 22 C e 37 C. 2. Principio del metodo La procedura analitica permette di contare le COLONIE di tutti i microrganismi (batteri, lieviti e funghi) cresciuti nella compagine del terreno agarizzato (tecnica dell inclusione in agar) analizzando aliquote note di campione miscelate con il substrato mantenuto fuso e lasciato successivamente solidificare in capsule di Petri.

6 Di seguito viene descritto il metodo (UNI EN ISO 6222:2001) stabilito dalla Rapporti ISTISAN 05/xx 2 Direttiva Europea 98/83/CE sulle acque destinate al consumo umano e recepito nel conseguente n. 31 del 2001. 3. Strumentazione e vetreria Normale attrezzatura di laboratorio (Appendice 1). 4. Terreni di coltura e reagenti Substrato di isolamento Agar all estratto di lievito Composizione Estratto di lievito 3 g Triptone 6 g Agar 15 g Acqua distillata 1000 mL pH 7,2 0,2 Il terreno si trova anche in commercio in forma disidratata e si prepara secondo le istruzioni della ditta produttrice.

7 Reidratare il terreno in acqua distillata. Riscaldare fino ad ebollizione agitando frequentemente. Distribuire in tubi in ragione di circa 15 mL/tubo e sterilizzare in autoclave a (121 3) C per 15 minuti. Conservare a (5 3) C per non pi di 2 settimane in condizioni ottimali. 5. Procedura Volume da analizzare Il volume di campione da analizzare, generalmente pari a 1 mL, comunque funzione della tipologia e della qualit dell'acqua da esaminare. Il metodo generalmente non consente di analizzare volumi superiori a 2 mL.

8 Semina del campione ed incubazione La procedura di analisi per l'enumerazione dei microrganismi a 37 C e a 22 C la stessa per entrambi i parametri. Tecnica dell inclusione in agar. Seminare sul fondo di capsule di Petri vuote aliquote non superiori a 2 mL del campione o di una sua diluizione. Versare, nelle capsule contenenti l'inoculo, circa 15 mL di substrato di isolamento ( ) mantenuto liquefatto alla temperatura di (45 1) C rispettando le comuni regole di asepsi. Non superare i 15 minuti di intervallo tra il momento dell'inoculo in capsula e l'aggiunta del terreno colturale.

9 Non mantenere il terreno in fusione in bagnomaria oltre le 4 ore. Mescolare accuratamente ruotando in un verso e nell'altro le capsule per permettere una completa miscelazione tra il terreno colturale ed il campione. Lasciare solidificare e porre ad incubare una capsula a (36 1) C per (40 48) ore e l altra a (22 1) C per (64 72) ore. Rapporti ISTISAN 05/xx CONTEGGIO ed interpretazione dei risultati Dopo il periodo di incubazione, per ciascuna temperatura di crescita, contare tutte le COLONIE con idoneo sistema di ingrandimento su fondo scuro e scartare le piastre con crescita confluente.

10 6. Espressione dei risultati Esprimere i risultati come numero di Unit Formanti Colonia per millilitro (UFC/mL) di campione per ciascuna temperatura di incubazione considerando l eventuale diluizione effettuata. Se, nelle piastre inoculate, non sono cresciute COLONIE , esprimere il risultato come non rilevato /mL. Se sono presenti pi di 300 COLONIE , esprimere il risultato come > 300/mL. BIBLIOGRAFIA 1. Allen M, Edberg S, and Reasoner D. Heterotrophic plate count (HPC) bacteria What is their significance in drinking water? In: Proceedings of the NFS International/WHO Symposium on Bacteria in drinking water.


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