CONTEGGIO DELLE COLONIE SU AGAR A 22 °C E 37 °C

1 rapporti istisan 05/xx 1 CONTEGGIO DELLE COLONIE SU AGAR A 22 C E 37 C 0. Generalit e definizioni Il CONTEGGIO DELLE COLONIE su agar un parametro che permette di rilevare un gruppo eterogeneo di microrganismi aerobi che hanno differenti capacit metaboliche e richieste nutrizionali. L uso di temperature diverse permette di mettere in evidenza microrganismi mesofili (a 37 C) e psicrofili (a 22 C). Molti di essi possono appartenere alla microflora ambientale autoctona DELLE acque, presente indipendentemente da qualsiasi contaminazione. Negli ultimi anni, il ruolo svolto nelle acque destinate al consumo umano dal gruppo di microrganismi indicati dagli anglosassoni sotto il nome di Heterotrophic Plate Count (HPC) ( CONTEGGIO degli eterotrofi) e corrispondente al termine CONTEGGIO DELLE COLONIE su agar, stato approfondito e riconsiderato.

2 L Organizzazione Mondiale della Sanit ha riconosciuto che gran parte degli studi epidemiologici pi recenti, volti alla verifica del rischio associato alla presenza di questi microrganismi nelle acque, ha confermato che non esistono evidenze che dimostrino che, in assenza di contaminazione fecale, i risultati ottenuti dalla determinazione dell HPC siano correlati con i rischi per la salute nella popolazione sana. Inoltre, stato pi volte sottolineato che i metodi analitici utilizzati per la determinazione del parametro si limitano a rilevare microrganismi vitali e non sono in grado di evidenziare patogeni eventualmente presenti nell acqua.

3 Nella Direttiva Europea 98/83/CE sulle acque destinate al consumo umano e nel conseguente n. 31 del 2001, il parametro riportato nella Parte A e nella Parte C (parametri indicatori) dell Allegato I. Se per le acque imbottigliate (Parte A) sono stabiliti valori di parametro ( CONTEGGIO a 22 C: 100/mL; CONTEGGIO a 37 C: 20/mL), alla concentrazione degli eterotrofi rilevabili nelle acque in distribuzione (Parte C) non stato assegnato alcun valore limite. La normativa stabilisce infatti che i valori del CONTEGGIO DELLE COLONIE a 22 C nelle acque in rete debbano presentarsi senza variazioni anomale , accettando quindi la possibilit che ogni tipo di acqua abbia comunque proprie caratteristiche di qualit e una flora microbica naturale.

4 Tuttavia, il superamento DELLE concentrazioni storicamente rilevate nell acqua in distribuzione pu segnalare la potenziale esistenza di condizioni di ricrescita batterica in rete e modifiche della qualit dell acqua. Il parametro va considerato indicatore di qualit e di efficienza di trattamento. Variazioni di concentrazione sono tollerate fermo restando quanto stabilito nell art. 14 del decreto e possono, in questo caso, essere segnalate come inosservanza del valore di parametro. 1. Campo di applicazione La procedura analitica viene utilizzata per il rilevamento, nelle acque sorgive, sotterranee e superficiali, destinate o da destinare al consumo umano e nelle acque ad uso ricreativo (piscine), di microrganismi aerobi coltivabili a 22 C e 37 C.

5 2. Principio del metodo La procedura analitica permette di contare le COLONIE di tutti i microrganismi (batteri, lieviti e funghi) cresciuti nella compagine del terreno agarizzato (tecnica dell inclusione in agar) analizzando aliquote note di campione miscelate con il substrato mantenuto fuso e lasciato successivamente solidificare in capsule di Petri. Di seguito viene descritto il metodo (UNI EN ISO 6222:2001) stabilito dalla rapporti istisan 05/xx 2 Direttiva Europea 98/83/CE sulle acque destinate al consumo umano e recepito nel conseguente n. 31 del 2001. 3. Strumentazione e vetreria Normale attrezzatura di laboratorio (Appendice 1).

6 4. Terreni di coltura e reagenti Substrato di isolamento Agar all estratto di lievito Composizione Estratto di lievito 3 g Triptone 6 g Agar 15 g Acqua distillata 1000 mL pH 7,2 0,2 Il terreno si trova anche in commercio in forma disidratata e si prepara secondo le istruzioni della ditta produttrice. Reidratare il terreno in acqua distillata. Riscaldare fino ad ebollizione agitando frequentemente.

7 Distribuire in tubi in ragione di circa 15 mL/tubo e sterilizzare in autoclave a (121 3) C per 15 minuti. Conservare a (5 3) C per non pi di 2 settimane in condizioni ottimali. 5. Procedura Volume da analizzare Il volume di campione da analizzare, generalmente pari a 1 mL, comunque funzione della tipologia e della qualit dell'acqua da esaminare. Il metodo generalmente non consente di analizzare volumi superiori a 2 mL. Semina del campione ed incubazione La procedura di analisi per l'enumerazione dei microrganismi a 37 C e a 22 C la stessa per entrambi i parametri.

8 Tecnica dell inclusione in agar. Seminare sul fondo di capsule di Petri vuote aliquote non superiori a 2 mL del campione o di una sua diluizione. Versare, nelle capsule contenenti l'inoculo, circa 15 mL di substrato di isolamento ( ) mantenuto liquefatto alla temperatura di (45 1) C rispettando le comuni regole di asepsi. Non superare i 15 minuti di intervallo tra il momento dell'inoculo in capsula e l'aggiunta del terreno colturale. Non mantenere il terreno in fusione in bagnomaria oltre le 4 ore. Mescolare accuratamente ruotando in un verso e nell'altro le capsule per permettere una completa miscelazione tra il terreno colturale ed il campione.

9 Lasciare solidificare e porre ad incubare una capsula a (36 1) C per (40 48) ore e l altra a (22 1) C per (64 72) ore. rapporti istisan 05/xx CONTEGGIO ed interpretazione dei risultati Dopo il periodo di incubazione, per ciascuna temperatura di crescita, contare tutte le COLONIE con idoneo sistema di ingrandimento su fondo scuro e scartare le piastre con crescita confluente. 6. Espressione dei risultati Esprimere i risultati come numero di Unit Formanti Colonia per millilitro (UFC/mL) di campione per ciascuna temperatura di incubazione considerando l eventuale diluizione effettuata.

10 Se, nelle piastre inoculate, non sono cresciute COLONIE , esprimere il risultato come non rilevato /mL. Se sono presenti pi di 300 COLONIE , esprimere il risultato come > 300/mL. BIBLIOGRAFIA 1. Allen M, Edberg S, and Reasoner D. Heterotrophic plate count (HPC) bacteria What is their significance in drinking water? In: Proceedings of the NFS International/WHO Symposium on Bacteria in drinking water. Public health implications? Geneve, 2002. 2. UNI EN ISO 6222:2001. Qualit dell acqua. Valutazione quantitativa dei microrganismi vitali. CONTEGGIO DELLE COLONIE per inoculo su terreno agarizzato.