Electroforesis de Proteínas - cultek.com

1 Electroforesis de Prote nas Las prote nas son mol culas cuya carga neta depende del contenido de una serie de amino cidos (fundamentalmente cido glut mico, cido asp rtico, lisina, arginina e histidina) y del grado de ionizaci n de stos al pH considerado (figura 7). Fig. 7. Principales amino cidos responsables de la carga neta de una prote na, dependiendo del pH. En los soportes no restrictivos (en los que el entramado no interfiere en la migraci n, ya que el tama o de las prote nas es muy peque o en comparaci n con el tama o de poro del soporte), la separaci n depende de la densidad de carga de las mol culas y, as , cuanto mayor sea la densidad, mayor ser la velocidad de migraci n en un campo el ctrico hacia el polo que determine su carga neta. La primera etapa del proceso es la aplicaci n de la muestra. En papel o acetato de celulosa, esto se puede efectuar de forma puntual (permite el an lisis de varias muestras simult neamente en peque as cantidades) o longitudinalmente (permite el estudio de una sola muestra pero en mayor cantidad).

2 La muestra se aplica disuelta en el tamp n de Electroforesis , del que est impregnado el soporte y que se encuentra en los reservorios de la cubeta, y se deposita en una peque a zona, lo m s estrecha posible, en el centro o en un extremo del soporte (si se conoce cu l va a ser la direcci n de desplazamiento de la misma) y de forma perpendicular a la direcci n del campo el ctrico. Conviene evitar la proximidad de los bordes del papel, ya que all el campo el ctrico no es homog neo y se distorsionan las bandas seg n avanzan. El volumen que se aplica suele ser inferior a 10 L y si se necesitan mayores vol menes porque la muestra se encuentre muy diluida, pueden hacerse aplicaciones sucesivas sobre la misma zona, dejando secar entre aplicaci n y aplicaci n. Es necesario humedecer el soporte (papel o acetato de celulosa) para que sea conductor; para ello, se impregna el soporte de tamp n de Electroforesis por ambos extremos y de forma simult nea para que por capilaridad se desplace hacia la zona de aplicaci n de la muestra.

3 En los geles de agarosa, se perfora el gel con ayuda de un troquel o una pipeta de di metro adecuado y se elimina esa porci n por succi n. La perforaci n puede ser cil ndrica o rectangular, dependiendo del n mero y cantidad de muestra a analizar y la muestra se deposita en el orificio practicado sin que llegue a rebosar. En este caso, el tamp n est embebido en el soporte (agarosa). En todos los casos, la zona de aplicaci n debe ser lo m s estrecha posible, para aumentar la resoluci n y evitar solapamientos entre bandas que migren en posiciones cercanas. La Electroforesis termina cuando se haya producido la m xima separaci n de los componentes de la muestra, pero sin sobrepasar los l mites del soporte. Para evitar que se sobrepasen estos l mites, se utilizan los marcadores electrofor ticos que son mol culas coloreadas con una movilidad electrofor tica superior a cualquier componente de la muestra (poseen elevada carga respecto a su tama o).

4 Entre los marcadores m s utilizados se encuentran la dinitrofenil-lisina (DNP-Lys) y el azul de bromofenol. Una vez acabada la Electroforesis , se procede a la etapa de tinci n. El soporte se retira de la cubeta y se sumerge en un recipiente que contiene una disoluci n de un colorante que se une de manera espec fica a los componentes de la muestra y que precipita a los componentes separados en la posici n en la que se encuentren. Las disoluciones m s utilizadas en el caso de prote nas son el Negro Amido al 1% (p/v) en cido ac tico y el Azul de Coomasie al (p/v) en metanol/agua/ cido ac tico (9:9:2 v/v/v). Si la Electroforesis se pretende desarrollar a escala preparativa, ha de utilizarse un papel de mayor grosor (175 gr/cm2), en lugar del utilizado en la Electroforesis anal tica (85-100 gr/cm2; de espesor), lo que permite la aplicaci n de una mayor cantidad de muestra (50-100 L). Inmunoelectroforesis.

5 Es una combinaci n de una Electroforesis en geles de agarosa seguida de una inmunodifusi n (figura 8). En la primera parte, se realiza una aplicaci n puntual de la muestra, por lo que al final las distintas prote nas estar n distribuidas a lo largo del gel seg n el eje de migraci n. Acabada la Electroforesis , y sin efectuar la tinci n, se practica en el gel un canal ( trinchera ) paralelo a la direcci n de migraci n con un bistur de doble hoja (la separaci n de las hojas determina la anchura de la trinchera) en el que se deposita un antisuero que contenga anticuerpos espec ficos frente a una o varias de las prote nas separadas en la Electroforesis . Los geles se mantienen as a temperatura ambiente (20-22 C) durante 24-48 horas. Los anticuerpos y las prote nas (que act an como ant genos) difunden, y si se encuentran en la proporci n adecuada, producen complejos ant geno-anticuerpo insolubles que precipitan y aparecen en el gel como bandas elipsoidales.

6 Estos complejos solamente se producen cuando ambos compuestos se hallan en lo que se conoce como relaci n de equivalencia y que no son id nticas para todas las prote nas presentes en la muestra; por eso, deben determinarse en experimentos preliminares las cantidades id neas de antisuero y de la muestra, as como las distancias entre el pocillo de aplicaci n de la muestra y la trinchera, ya que si las distancias son muy peque as, el ant geno (las prote nas) difunde r pidamente y puede no formarse el precipitado, y si la distancia es mayor de la id nea, hay que emplear mayor cantidad de antisuero y la duraci n del proceso se alarga. Una vez formadas las bandas de precipitaci n, el gel puede lavarse para eliminar las prote nas que no hayan inmunoprecipitado y, posteriormente, te irse como se ha descrito anteriormente. Cada prote na de la muestra produce una banda de precipitaci n independiente, por lo que es posible identificar el n mero de constituyentes de la muestra que son reconocidos por los anticuerpos.

7 Soluciones ElectroforesisProtocolo y T gina 1 de 17La gran especificidad y sensibilidad de las reacciones de precipitaci n, permite diferenciar substancias con movilidades electrofor ticas id nticas y detectar componentes que se encuentren en concentraciones m nimas ( g). Fig. 8. Fases de una inmunoelectroforesis (IEF). El n mero de bandas observado en una IEF debe entenderse como el n mero m nimo de componentes presentes, es decir, puede haber m s componentes que no sean detectados por el antisuero empleado o que no hayan alcanzado la relaci n de equivalencia ant geno-anticuerpo adecuada. La IEF es una t cnica principalmente cualitativa, que se desarrolla en condiciones nativas y es especialmente apropiada para el an lisis de l quidos fisiol gicos y extractos celulares. Permite identificar substancias en mezclas muy complejas y en concentraciones muy bajas.

8 Sin embargo, requiere que dichas substancias sean inmunog nicas y depende de los anticuerpos utilizados, por lo que es dif cil de estandarizar. Electroforesis en Geles de Poliacrilamida (PAGE). Se utiliza mayoritariamente para la separaci n de prote nas, aunque tambi n puede ser til para cidos nucleicos. Los geles de poliacrilamida son soportes restrictivos del tipo II, por lo que, adem s de evitar la convecci n y minimizar la difusi n, participan directamente en el proceso de separaci n. Se preparan de modo que sus poros sean de un tama o comparable al de las prote nas, de manera que produzcan un efecto de tamizado molecular; la separaci n electrofor tica depende entonces de la densidad de carga de las mol culas y de su tama o, por lo que dos prote nas con id ntica densidad de carga, pero de tama o diferente pueden ser separadas, ya que el soporte dificulta m s el avance de la de mayor tama o.

9 Son qu micamente inertes frente a las mol culas biol gicas, transparentes y estables en un amplio intervalo de valores de pH, temperatura y fuerza i nica; son tambi n resistentes a agentes desnaturalizantes (urea, detergentes), no presentan efecto EEO y son mec nicamente estables, por lo que pueden ser deshidratados y reducidos a una fina pel cula, lo que facilita su almacenamiento. Preparaci n del soporte. El soporte se prepara a partir del mon mero de acrilamida (figura 9) que forma largas cadenas lineales, con abundantes grupos polares que las hace solubles en medios acuosos. Al no estar las cadenas unidas entre s , formar an un gel sin consistencia mec nica y totalmente inmanejable. Para evitar esto, se utiliza otro mon mero, la N,N -metilen-bisacrilamida que forma parte de dos cadenas que quedan as unidas covalentemente. Fig. 9. Estructura de la acrilamida, bisacrilamida y poliacrilamida En funci n de la concentraci n de acrilamida se obtienen entramados m s o menos densos, mientras que la cantidad de bisacrilamida condiciona el grado de entrecruzamiento de las cadenas.

10 Ambos componentes determinan, en conjunto, las caracter sticas f sicas del gel resultante: su resistencia mec nica, fragilidad, elasticidad, grado de reticulaci n (tama o de poro), etc. Soluciones ElectroforesisProtocolo y T gina 2 de 17La polimerizaci n de la acrilamida se obtiene por la adici n de catalizadores de la polimerizaci n que inician y aceleran el proceso de formaci n de un gel tridimensional. Normalmente, el proceso se inicia con la adici n de persulfato am nico a una disoluci n acuosa (tamp n) de ambos mon meros (acrilamida + bisacrilamida), seguido de la adici n de TEMED (N,N,N ,N -tetrametilendiamina) que act a como propagador de la reacci n de polimerizaci n a pH b sico (el pH cido retarda la polimerizaci n). Por lo tanto, ajustando las concentraciones de persulfato y TEMED puede controlarse la velocidad de polimerizaci n. Siempre debe evitarse la presencia de ox geno, pues inhibe la polimerizaci n; por ello, la mezcla de polimerizaci n debe desgasificarse a vac o (lo que impide, adem s, la formaci n de burbujas durante la polimerizaci n que distorsionan el gel y alteran el campo el ctrico).