ELECTROFORESIS - UNP

1 Q U M I C A B I O L G I C A . D E P A R T A M E N T O D E B Q C A. F C N Y C S . U N P S J B 2 0 1 7 ELECTROFORESIS Que es la ELECTROFORESIS ? Qu permite analizar? Que factores influyen ? Separar y analizar mol culas: prote nas ADN/ARN .. en funci n de su diferente movilidad al aplicar un campo el ctrico (depender de su carga el ctrica) * Mol c. (+) polo (-) o c todo * Mol c. (-) polo (+) o nodo ELECTROFORESIS LIBRE mol culas en disoluci n o suspensi n: poco resolutiva ELECTROFORESIS DE ZONA SOPORTE que retiene las mol culas: elevado poder de resoluci n c todo nodo nodo c todo SOPORTE pH bajo: carga neta positiva pI: carga neta nula pH alto.

2 Carga neta negativa EQUIPO ELECTROFOR TICO - + muestra muestra + - fuente de alimentaci n fuente de alimentaci n cable cable cubeta cubeta tamp n tamp n gel gel electrodo electrodo c todo nodo electrodo c todo nodo * Fuente de alimentaci n * Cubeta * Tamp n de ELECTROFORESIS * Soporte electrofor tico (gel) * Dos electrodos nodo (+) c todo (-) Componentes: (E. horizontal) (E. vertical) FACTORES QUE AFECTAN A LA ELECTROFORESIS 1_ Campo el ctrico *Diferencia de potencial (V-voltios): bajo voltaje (10-500 V) alto voltaje (500-10000 V) *Intensidad (A-amperios): flujo de carga el ctrica depende de V y de R (Ley de Ohm V=RxI) *Resistencia (R): determinada por el soporte y tamp n ELECTROFORESIS *Temperatura: efecto Joule.

3 El aumento de temperatura generado puede da ar el soporte, el equipo electrofor tico y desnaturalizaci n de las proteinas refrigerantes 2_ Muestra *Carga o densidad de carga: carga el ctrica/masa de la mol cula *Tama o *Forma: formas globulares avanzan m s 3_ Tamp n de ELECTROFORESIS *pH: determina el grado de solvataci n y la carga de las mol culas generalmente es ligeramente b sico mol culas (-) *Fuerza i nica: generalmente o M para que no interfiera 4_ Soporte SOPORTE ELECTROFOR TICO No restrictivo (Tipo I): Tama o poro >>> mol culas, no opone impedimento a su paso separaci n s lo por CARGA * ELECTROFORESIS de prote nas: Papel, almid n, agar, acetato de celulosa Gel poroso Caracter sticas Gel poroso (entramado tridimensional interno) Tiene que permitir el paso de mol culas Material inerte: NO puede estar cargado y no debe adsorber las mol culas de la muestra Tipos de Soporte Restrictivo (Tipo II).

4 Tama o poro mol culas, opone resistencia a su paso separaci n por tama o (tamizado molecular) * ELECTROFORESIS de prote nas: Separaci n por CARGA y TAMA O Acrilamida * ELECTROFORESIS de DNA/RNA: Separaci n s lo por TAMA O Agarosa, acrilamida EN ACETATO DE CELULOSA: PROTEINOGRAMA + - Campo el ctrico (DV) Soporte: (no restrictivo) Tiras de acetato de celulosa ELECTROFORESIS horizontal 1.

5 Aplicaci n de la muestra 2. ELECTROFORESIS 3. Detecci n por tinci n: Azul de Coomassie Negro amido 4. Densitometr a / Espectrofotometr a Aplicaciones diagn sticas en serolog a (separaci n prote nas s ricas). muestra Avance de las prote nas EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE) ELECTROFORESIS vertical Soporte: (restrictivo) Gel de Poliacrilamida * Polimerizaci n de dos componentes: Acrilamida + Bisacrilamida * Variaci n de la concentraci n variaci n del tama o de poro [poliacrilamida] tama o poro 1.

6 Preparaci n del gel 2. Montaje de la cubeta 3. Aplicaci n de la muestra 4. ELECTROFORESIS 5. Detecci n por tinci n: Azul de Coomassie Sales de plata Aplicaciones: * Separar prote nas * Determinar peso molecular de una prote na * Separar prote nas oligom ricas * Separar prote nas en funci n de su pI * Separar prote nas de mezclas muy complejas * Ver si hay una prote na en concreto EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE) SDS-PAGE ELECTROFORESIS 2D Western Blot Electroenfoque Ventajas: * Gran poder de separaci n por CARGA y por TAMA O * Qu micamente inertes * Transparentes (permite densitometr a) * Estables (pH, fuerza i nica, temperatura) * Versatilidad en cuanto al tama o de poro y entramado uniforme SDS-PAGE Condiciones de la PAGE: * No desnaturalizantes: separamos por CARGA y TAMA O PAGE S-S S-S - - - - - - - - - - - - - - - + SDS + DTT 25 kDa S-S + SDS - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 44 kDa S-S S-S 50 kDa * Desnaturalizantes.

7 Separamos s lo por TAMA O SDS-PAGE Agentes desnaturalizantes: SDS (dodecilsulfato s dico), urea, reductores (DTT, b-mercaptoetanol).. SDS: detergente ani nico (-), dota a todas las prote nas de carga (-) todas migrar n hacia el nodo (+), separ ndose s lo por tama o SDS-PAGE: determinaci n del peso molecular Marcadores de peso molecular: * Mezcla de diferentes prote nas pre-te idas de las que conocemos el peso molecular. * Por comparaci n podemos averiguar el PM de nuestra prote na.

8 A trabajar se ha ajo Pr ctico ELECTROFORESIS en tiras de acetato de celulosa Separar mediante ELECTROFORESIS las prote nas contenidas en el suero. ELECTROFORESIS en gel de poliacrilamida Calcular gr ficamente la masa molecular aparente de prote nas por comparaci n con prote nas patrones en un grafico de distancia vs Log PM aparente. ELECTROFORESIS en tiras de acetato de celulosa Tipo de ELECTROFORESIS .. Soporte: acetato de celulosa ( conservadas en metanol). Muestra: suero humano. pH de trabajo: 8, 5 Buffer: Veronal S dico.

9 Siembra: con aplicador , en c todo o nodo? Voltaje: 2mA por tira. Tiempo de corrida: 45 minutos. Revelado: Amidoschwart o Ponceau. Soluci n decolorante: metanol, agua y acido ac tico ( 47,5:47,5: 5). Disoluci n de cada banda: Acido Ac tico al 80 %. Cuantificaci n espectrofotom trica a 495 nm. ELECTROFORESIS en gel de poliacrilamida