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French WB webinar (18 Feb) - docs.abcam.com

Western BlotIntroduction et Optimisation20 f vrier 201320 f vrier 2013 Guillaume Boucher, PhDSuperviseur - Support ScientifiqueWestern Blot Qu est-ce que le Western Blot? Egalement appel immunoblot Technique utilis e pour identifier une prot ine dans un chantillon contenant plusieurs prot inesComment a marche? Les prot ines d un chantillon sont s par es par lectrophor se en fonction de leur poids mol culaire Un anticorps sp cifique est ensuite utilis pour d tecter la prot ine d int r t Le r sultat permet de d terminer le poids mol culaire et la quantit relative de la prot ine2puits 1: Anticorps anti- Actine (ab8226) dilu au 1/1000puits 2: ab8226 dilu au 1/10000puits 3-4: ab8226 dilu au 1/500puits 1: Lysat cellulaire HeLa (humain)puits 2: Lysat cellulaire HeLa (humain)puits 3: Lysat cellulaire HEK293 (humain)puits 4: Lysat cellulaire 3T3 (souris) Pourquoi utiliser la technique du Western Blot ? La prot ine d int r t est-elle pr sente dans mon chantillon ?

Pourquoi utiliser la technique du Western Blot ? La protéine d’intérêt est-elle présente dans mon échantillon ? Est-ce que le traitement de mon échantillon par un

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1 Western BlotIntroduction et Optimisation20 f vrier 201320 f vrier 2013 Guillaume Boucher, PhDSuperviseur - Support ScientifiqueWestern Blot Qu est-ce que le Western Blot? Egalement appel immunoblot Technique utilis e pour identifier une prot ine dans un chantillon contenant plusieurs prot inesComment a marche? Les prot ines d un chantillon sont s par es par lectrophor se en fonction de leur poids mol culaire Un anticorps sp cifique est ensuite utilis pour d tecter la prot ine d int r t Le r sultat permet de d terminer le poids mol culaire et la quantit relative de la prot ine2puits 1: Anticorps anti- Actine (ab8226) dilu au 1/1000puits 2: ab8226 dilu au 1/10000puits 3-4: ab8226 dilu au 1/500puits 1: Lysat cellulaire HeLa (humain)puits 2: Lysat cellulaire HeLa (humain)puits 3: Lysat cellulaire HEK293 (humain)puits 4: Lysat cellulaire 3T3 (souris) Pourquoi utiliser la technique du Western Blot ? La prot ine d int r t est-elle pr sente dans mon chantillon ?

2 Est-ce que le traitement de mon chantillon par un agent X augmenteou r duit le niveau 3agent X augmenteou r duit le niveau d expression de ma prot ine ?Le niveau d expression de la prot ine est-il diff rent selon le type de tissu ou le type de cellule ?Mon chantillon est-il sain ou pathologique ? Le Western Blot permet de d tecter par exemple la maladie de Lyme, de la vache folle, HIV, 1: Pr paration des chantillonsEtape 2: Gel d lectrophor seEtape 3: Transfert des prot inesPlan de la pr sentation4 Etape 4: Immunod tectionContr les utiliser en Western Blot Choix de l anticorpsConseils techniques et exemplesLiens utiles et autres produits utilesEtape 1: Pr paration des chantillonsEtape 2: Gel d lectrophor seEtape 3: Transfert des prot inesPlan de la pr sentation5 Etape 4: Immunod tectionContr les utiliser en Western Blot Choix de l anticorpsConseils techniques et exemplesLiens utiles et autres produits utilesPr paration des chantillons pour l lectrophor seLyse Les cellules ou les tissus sont trait es avec un tampon de lyse puis d grad s m caniquement pour lib rer les prot ines Cellules Garder les cellules sur la glace, les laver avec du PBS froid, ajouter le tampon de lyse (~ 1 ml pour 10 millions de cellules), puis agiter pendant 30 minutes 4 C.

3 Tissu Diss quer rapidement le tissu et le garder sur la glace, le plonger rapidement dans de l azote liquide, reprendre le tissu dans le tampon de lyse (300 l pour 5 mg de tissu), rincer les lames du broyeur avec 2 x 300 l de 6 Mesurer la concentration en prot ines(300 l pour 5 mg de tissu), rincer les lames du broyeur avec 2 x 300 l de tampon, puis agiter pendant 2 heures 4 C. Centrifuger 4 C pendant 20 minutes, aspirer le supernageant et le garder sur la glaceConditions r ductrices et d naturantes Les chantillons sont galement trait s avec des agents permettant de casser les structures prot iques tridimensionnelles (dim res, structures tertiaires) Ajouter le tampon de charge l chantillon et chauffer 5 minutes 95-100 C ou pendant 5-10 minutes 70 CLyseMaintenir les chantillons sur glace ou a 4 C pour viter toute d gradation des prot inesLes tampons doivent tre fraichement pr par s, maintenus froid et un cocktail d inhibiteurs de prot ases doit tre ajout avant de commencer la lyseSi la prot ine d int r t est phosphoryl e, s assurer d ajouter des inhibiteurs de phosphatases au tampon de lyseChoisir un tampon de lyse ad quat en fonction de la localisation cellulaire de la prot ine 7 Choisir un tampon de lyse ad quat en fonction de la localisation cellulaire de la prot ine d int r tLocalisation de la prot ine Tampon de lyse recommand Cellule enti re NP-40 ou RIPAC ytoplasmique (soluble) Tris-HClCytoplasmique (cytosquelette)

4 Tris-TritonMembranaireNP-40 ou RIPANucl aireRIPAM itochondrialeRIPAC onditions D naturantes et R ductricesUn tampon de charge type contient du SDS (sodium dodecyl sulfate) et du -mercapto thanol ou DTT (dithiothr itole) Le SDS lin arise la prot ine en structure primaire d acides amin s et la recouvre de charges n gatives Le -mercapto thanol et le DTT sont des agents r ducteurs qui cassent les ponts disulfures Les prot ines peuvent ainsi tre s par es selon leur poids mol culaire par 8 Les prot ines peuvent ainsi tre s par es selon leur poids mol culaire par SDS-PAGE Ce traitement permet galement de rendre accessible le site de fixation l anticorpsSDS et DTT/ -mercapto thanolRemarque : certains anticorps reconnaissent uniquement les prot ines non-r duites et/ou non-d natur es, Le SDS et/ou le -mercapto thanol ou DTT ne doivent alors pas tre pr sents dans le tamponLe protocole de Western BlotEtape 1: Pr paration des chantillonsEtape 2: Gel d lectrophor se Etape 3: Transfert des prot ines9 Etape 4: Immunod tectionContr les utiliser en Western Blot Choix de l anticorpsConseils techniques et exemplesLiens utiles et autres produits utilesSDS-PAGED finitionM thode permettant de s parer les prot ines gr ce un champ lectrique en fonction de leur mobilit lectrophor tique10 SDS : Sodium Dodecyl Sulfate ; PAGE : PolyAcrylamide Gel ElectrophoresisComment a marche?

5 Un gel de polyacrylamide est plac dans un compartiment dans lequel un tampon de migration est ajout . Le tampon de migration standard est constitu de 25mM Tris; 190mM glycine; 0,1% SDS; pH 8,3 Les lysats prot iques sont charg s sur le gel; typiquement 20 - 40 g par puits Un champ lectrique est appliqu pour que les prot ines migrent vers le p le positif (anode) Les prot ines trait es au SDS sont uniform ment recouvertes de charges n gatives, minimisant ainsi les charges endog nes des prot inesSDS-PAGE marche? n gatives, minimisant ainsi les charges endog nes des prot ines Les prot ines sont ainsi s par es selon leur poids mol culaire Les petites prot ines sont moins retenues par le maillage du gel et migrent plus rapidement-+Courant lectriqueFront de migration11 GelsConstitu s d acrylamide, N,N-methylenebisacrylamide (Bis), persulfate d'ammonium (APS) et TEMEDLa structure du gel peut tre modifi e en changeant le pourcentage d acrylamidePour des prot ines de petites tailles, utiliser un gel avec un pourcentage lev , et un pourcentage moindre pour les prot ines de grandes de la prot ine (kDa)

6 Pourcentage du gel4-402012-451510-7012,515-1001025-2008 Les gels gradient sont recommand s lorsque la taille de la prot ine d int r t est m connueElectrophor se en conditions non-r duites et/ou non-d naturantesForme d sir e de la prot ineCondition du gel Tampon de chargeTampon de migrationR duite - D natur eR ductrice & D naturante Avec -mercapto thanol ou DTT Avec SDSAvec SDSR duite -Native R ductrice & Avec -mercapto thanol Sans SDS13R duite -Native R ductrice & Non-D naturanteAvec -mercapto thanol ou DTTSans SDSSans SDSOxyd e - D natur eNon-R ductrice & D naturanteSans -mercapto thanol ou DTTAvec SDSAvec SDSOxyd e - NativeNon-R ductrice & Native Sans -mercapto thanol ou DTTSans SDSSans SDSStep 1: Sample PreparationStep 2: Gel Electrophoresis Step 3: Protein TransferEtape 1: Pr paration des chantillonsEtape 2: Gel d lectrophor seEtape 3: Transfert des prot inesLe protocole de Western Blot14 Step 4: ImmunodetectionControls to use in Western Blot Antibody SelectionTroubleshooting Tips et ExamplesProtocol Resources et ProductsEtape 4: Immunod tectionContr les utiliser en Western Blot Choix de l anticorpsConseils techniques et exemplesLiens utiles et autres produits utilesPrincipe du transfertApr s l lectrophor se, il faut marquer la prot ine d int r t afin de la visualiserUn gel n est pas une bonne surface pour marquer les prot ines15Un gel n est pas une bonne surface pour marquer les prot ines Les anticorps ne sont pas maintenus sur un gel Les gels sont fragiles et difficiles a manipulerIl est donc n cessaire de transf rer les prot ines sur une surface plus ad quateComment s effectue le transfert ?

7 Le principe est similaire celui du PAGE, savoir que les prot ines charg es n gativement migrent vers l anode sous l effet d un champ lectriqueUne membrane est incorpor e entre le gel et l anodeLes prot ines adh rent la membrane selon leur m me disposition sur le gelLes membranes peuvent tre de nitrocellulose ou de PolyVinyliDeneFluoride16 Les membranes peuvent tre de nitrocellulose ou de PolyVinyliDeneFluoride(PVDF). Les membranes PVDF requi rent un pr traitement au m thanolMontage du transfertTransfert en milieu humide ou semi-sec ?Inconv nientsAvantagesTransfert milieu humide Le gel et la membrane sont plac s entre les fines ponges et le papier absorbant. Le montage est immerg dans un compartiment rempli de tampon de transfert o le courant lectrique est appliqu Le tampon de transfert est typiquement Le temps de transfert est plus longPr f rable pour les prot ines de grandes tailles ou difficiles transf rer17constitu de 25mM Tris, 190mM glycine et 20% de M thanolTransfert semi-sec Le montage papier-gel-membrane-papier est imbib de tampon de transfert Le montage est plac directement entre la cathode et l anode o le courant est appliqu Le tampon de transfert est typiquement constitu de 48mM Tris, 39mM glycine, 0,04% SDS, et 20% M thanolRapideRisque d ass chement de la membrane pouvant affecter le transfert des prot inesTransfert des prot ines >100 kDaTransfert en milieu humide sur la nuit 4 C un faible voltageAjouter 0.

8 1% de SDS au tampon de transfert pour minimiser la formation d agglom rats sur le gel 18d agglom rats sur le gel R duire la quantit de m thanol dans le tampon le transfert 10% ou m me en de , permettant d viter la dispersion des prot ines sur le gelSi une membrane PVDF est utilis e, le m thanol peut tre totalement retir du tampon (mais la membrane doit n anmoins tre pr -activ e) Le protocole de Western BlotStep 1: Sample PreparationStep 2: Gel Electrophoresis Step 3: Protein TransferEtape 1: Pr paration des chantillonsEtape 2: Gel d lectrophor seEtape 3: Transfert des prot ines19 Step 4: ImmunodetectionControls to use in Western Blot Antibody SelectionTroubleshooting Tips et ExamplesProtocol Resources et ProductsEtape 4: Immunod tectionContr les utiliser en Western Blot Choix de l anticorpsConseils techniques et exemplesLiens utiles et autres produits utilesPourquoi utiliser un anticorps ? La coloration par le bleu de Coomassie peut tre utilis pour visualiser toutes les prot ines s par es par SDS-PAGEMais comment d terminer quelle bande SDS320 Mais comment d terminer quelle bande correspond la prot ine d int r t ?

9 L utilisation d anticorps d tectant la prot ine d int r t permet de r pondre cette question en fixant uniquement la prot ine d int r tLysat cellulaire de SDS3 transfect es (ab94303) en SDS-PAGE ( gauche) et en Western Blot avec l anti-SDS3 ab89345 ( droite) Proc dure d immunod tectionBlocage de la membraneLait, BSA, etcIncubation avec l anticorps primaireAnticorpsEpitopeProt ineProt ine21 Lavage (TBST)Lavage (TBST)Incubation avec un anticorps secondaire conjugu AnticorpsProt ineProt ineD tection Prot ineD tectionUn substrat chimio-luminescent tel que le ECL r agit avec un anticorps Substrat(peroxyde d'hydrog ne + luminol)3-aminophtalate(produit photo-sensible)Les substrats chromog nes (4-chloronaphthol ou DAB) fonctionnent galement avec la HRP ou la AP et produisent un produit color qui se d pose sur la membrane proximit de l anticorpsUn substrat chimio-luminescent tel que le ECL r agit avec un anticorps secondaire coupl la HRP et produit un signal visible sur filmLes anticorps secondaires coupl s des fluorophores (aussi appel s fluorochromes) sont utilis s avec des syst mes de d tection sp ciaux22 ECL : Enhanced ChemiLuminescenceHRP : HorseRadish PeroxidaseDAB : 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochlorideAP : Alkaline PhosphataseStep 1: Sample PreparationStep 2: Gel Electrophoresis Step 3: Protein TransferEtape 1: Pr paration des chantillonsEtape 2: Gel d lectrophor seEtape 3: Transfert des prot ines23 Step 4: ImmunodetectionControls to use in Western Blot Antibody SelectionTroubleshooting Tips et ExamplesProtocol Resources et ProductsEtape 4.

10 Immunod tectionContr les utiliser en Western Blot Choix de l anticorpsConseils techniques et exemplesLiens utiles et autres produits utilesContr les de ChargeLes contr les de charge sont des anticorps utilis s pour v rifier que le d p t de prot ines est identique dans chaque puits du gel SDS-PAGEUn contr le de charge correspond la d tection d une prot ine hautement conserv e et ubiquitaire (pr sente de fa on gale quelque soit le type d chantillon)Contr le de chargeType d chantillonPoids mol culaire (kDa)Mise en garde Actine Cellule enti re / cytoplasme42 Inadapt pour les chantillons de muscles squelettiques. Les changements dans l tatde croissance cellulaire et les interactions avec les l ments de la matrice extracellulairepeuvent affecter la synth se prot ique (Farmer et al, 24matrice extracellulairepeuvent affecter la synth se prot ique (Farmer et al, 1983)GAPDHC ellule enti re / cytoplasme30-40 Certains facteurs physiologiques, tels que l hypoxie ou le diab te, augmentent le niveau d expression de la GAPDH dans certains types cellulairesTubulineCellule enti re / cytoplasme55L expression de la tubuline varie avec la r sistance aux mol cules antimicrobiennes et antimitotiques (Sangrajrang S.))


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