HPLC - winklmair.de

1 -1- VERSUCH: HPLC -2- 1 Versuch HPLC Aufbau und Funktionsprinzip einer HPLC-Anlage Einf hrung: Der Name Chromatographie geht auf die fr hen Anf nge dieser Technik zur ck, bei denen verschiedene Farbstoffgemische getrennt wurden. Tswett, der als Begr nder der modernen Chromatographie gilt, benutzte ab 1906 als erster die Begriffe Chromatographie und Chromatogramm. Chromatographie bedeutet w rtlich "Farbschreibung". Nach einer l ngeren Entwicklung entstand in den letzten Jahrzehnten die modernste Form der chromatographischen Trenntechnik, die Hochleistungs- bzw.

2 Hochdruckfl ssigkeitschromatographie. Die Abk rzung HPLC kommt aus dem Englischen (High Performance (Pressure) Liquid Chromatography). Prinzip der Chromatographie Bei allen chromatographischen Verfahren werden Stoffgemische in Einzelkomponenten aufgetrennt. Allen Chromatographiearten ist gemeinsam, da ein L sungsmittel (oder Gas), die mobile Phase, an einer unbeweglichen station ren Phase vorbeistr mt. Besitzen die Komponenten unterschiedliche Affinit t zur station ren bzw.

3 Mobilen Phase, k nnen sie getrennt werden. Komponenten, welche schw cher an die station re Phase gebunden werden, von der mobilen Phase st rker mitgerissen und verlassen die station re Phase fr her. Umgekehrt wandern Probenbestandteile, welche stark an die station re Phase gebunden werden, langsamer. Anwendungsgebiete der HPLC Die HPLC ist ein sehr vielseitig einsetzbares Analyseninstrument. Anwendung findet die HPLC unter anderem in folgenden Bereichen: Lebensmittelanalytik Umwelt berwachung Klinische Chemie Medizinische Forschung Biochemie Prozesskontrolle in verschiedenen industriellen Zweigen Gegen ber der Gaschromatographie hat die HPLC folgende Vorteile: Es k nnen Substanzen untersucht werden, die nicht fl chtig sind bzw.

4 Nicht unzersetzt verdampfbar sind. Meistens sind die Trennzeiten bei der HPLC geringer. Die Gaschromatographie bleibt, trotz der Fortschritte der HPLC in den letzten Jahren, eine unverzichtbare und vielseitige Analysentechnik. -3- Ger teaufbau: Aufbau einer HPLC-Anlage: Ein HPLC-Ger t besteht im allgemeinen aus folgenden Teilen: - Eine oder mehrere Kolbenpumpen - Injektor - Trenns ule - Detektor - Schreiber oder Integrator bzw. Rechner (Bei den modernen HPLC-Ger ten bernimmt der Rechner nicht nur die Aufnahme und Verarbeitung der Me daten, sondern steuert die gesamte HPLC.)

5 Eluentenvorratsgef HPLC-PumpeEdelstahlkapillareInjektorTren ns uleDetektorSchreiberPrinzipieller Aufbau einer HPLC -4- Die Trenns ule: Trenns ulen f r analytische Zwecke sind meist Stahlrohre mit einem Innendurchmesser von 2-5mm, die mit der station ren Phase gef llt sind. An das Materials des Rohres werden besondere Anforderungen gestellt. Es mu korrosionsbest ndig sein, hohen Dr cken standhalten und chemisch innert gegen ber den zu trennenden Substanzen sein.

6 Gelegentlich werden auch Trenns ulen aus Glas oder Kunststoff verwendet. Da die meisten S ulenf llungen empfindlich gegen Druckst e sind, sollte die F rderrate der Pumpe nicht abrupt ge ndert werden. S ulenk rperS ulenf llungEdelstahlfritteEndverschraubungGewi nde zum Anschlu der EdelstahlkaAufbau einer Trenns ule S ulenf llmaterialien: Das am meisten verwendete F llmaterial f r Trenns ulen ist chemisch ver ndertes Kieselgel. Kieselgel besteht aus dreidimensional vernetztem SiO2, wobei die freien Enden durch OH-Gruppen abgeschlossen werden.

7 Hergestellt werden Silikagele durch saure Hydrolyse von geeigneten Siliziumverbindungen wie Natriumsilikat. Es entsteht dabei Monokiesels ure, die durch Kondensation (= Wasserabspaltung) Polykiesels ure bildet. Meistens wird in der HPLC kein reines Kieselgel verwendet, sondern chemisch modifiziertes. Durch ein geeignetes Reagenz wird an die freien OH-Gruppen ein organischer Rest angekoppelt. Die meistens verwendeten S ulenf llmaterialien sind sogenannte Reversed Phase Kieselgele.

8 (Bei der klassischen Chromatographie wird als station re Phase polares, chemisch nicht ver ndertes Kieselgel verwendet und als mobile Phase ein unpolares L sungsmittel. Bei Reversed-Phase Materialien werden Kohlenwasserstoffketten an die OH-Gruppen gebunden, wodurch das Kieselgel unpolar wird. Als mobile Phase werden polare L sungsmittelgemische verwendet.) Reversed Phase S ulen zeigen gegen ber den normalen Kieselgelf llungen h here Trennleistungen und h here Belastbarkeit.

9 Da die Trennleistung einer S ule mit sinkender Teilchengr e der station ren Phase zunimmt, haben die heute verwendeten S ulenf llmaterialien eine Korngr e zwischen 4 m und 10 m bei einer engen Korngr enverteilung. Da die Teilchen in einer S ule dicht gepackt sind, ergeben sich hohe Str mungswiderst nde, so da bei den blichen F rdermengen der mobilen Phase von 0,5-2ml/min Dr cke zwischen 80 und 200bar entstehen. -5- Chromatographiearten Je nach Art der Wechselwirkung zwischen station rer Phase, mobiler Phase und Probenkomponenten unterscheidet man folgende wichtige fl ssigchromatographische Verfahren: Adsorptionschromatographie.

10 Als station re Phase dient ein relativ polares Material mit gro er spezifischer Oberfl che (als Adsorbens wird meistens Silikagel verwendet, wobei die auf der Oberfl che sitzenden Silanolgruppen die aktiven Zentren darstellen). Als mobile Phase werden L sungsmittel verwendet, die gegen ber der station ren Phase unpolar sind. Polare Substanzen werden st rker an die station re Phase adsorbiert und eluieren sp ter als unpolare Stoffe. Die Methode wird angewendet: zur Trennung unterschiedlich polarer organischer Substanzen.