J. L. López-Hontangas, F. J. Castillo y M. Salavert

1 Cap tulo 3 T cnicas de identificaci n J. L. L pez-Hontangas, F. J. Castillo y M. Salavert 1. Introducci n El prop sito fundamental del diagn stico microbiol gico cl nico es optimizar la asistencia que se presta al paciente. Para alcanzar este objetivo es esen- 3. cial obtener y comunicar, lo antes posible, al m dico responsable del mismo resultados tiles para su manejo y tratamiento, usando eficientemente los recursos disponibles. Conjugar estos objetivos, con el m ximo rigor cient fico y una creciente demanda asistencial, es lo que se persigue en los Servicios de Microbiolog a Cl nica.

2 El diagn stico etiol gico directo de las enfermedades infecciosas pretende demostrar la presencia del microorganismo causal en productos patol gicos ade- cuados obtenidos del paciente e incluye, entre otros procedimientos, el cultivo, el cual persigue el aislamiento del microorganismo causante de la infecci n. Cuando es factible, el cultivo se considera el m todo diagn stico de elecci n, porque permite la identificaci n del microorganismo implicado, el estudio de su sensibilidad a los antimicrobianos apropiados y facilita la aplicaci n de marcadores epidemiol gicos.

3 Una vez aislado el microorganismo de la muestra, se procede a su identi- ficaci n, es decir, a clasificarlo dentro de un grupo o tax n ya establecido, con el que tenga la mayor semejanza. La complejidad de este proceso depende del nivel de precisi n o discriminaci n que se pretende conseguir. Aunque en los ltimos a os se ha asistido a un crecimiento importante en la oferta de m todos genot picos aplicados al diagn stico microbiol gico, en la mayor parte de los procesos de identificaci n se siguen utilizando m todos fenot picos, puesto que su realizaci n, lectura y coste los hacen m s asequibles.

4 En este cap tulo se revisan las t cnicas de identificaci n de las bacterias pat genas. Los m todos cl sicos para la tipificaci n de las bacterias se basan en sus caracter sticas morfol gicas y metab licas. Las pruebas diagn sticas se seleccionan en una base emp rica, con el fin de proporcionar informaci n sufi- 03#Tecnicas(Lopez).indd 27 10/10/07 13:27:14. 28 Microbiolog a aplicada al paciente cr tico T cnica ciente para hacer posible la discriminaci n entre los g neros y especies. Adem s, hoy en d a, las t cnicas de biolog a molecular (basadas en la caracterizaci n de genes espec ficos o segmentos de ellos) son cada vez m s comunes y utilizadas en Microbiolog a Cl nica.

5 2. Objetivos Y utilidad DE LAS T CNICAS DE identificaci n La identificaci n de una bacteria sospechosa de ser la causa de una infec- ci n es uno de los instrumentos principales del diagn stico y tratamiento de las enfermedades infecciosas. Diferenciar un microorganismo pat geno per se, potencialmente pat geno o contaminante, y deducir sus posibles mecanismos de resistencia, facilita el tratamiento de la enfermedad infecciosa con la mayor eficiencia posible. Tambi n permite realizar un seguimiento y control de las infec- ciones hospitalarias, detectar un posible brote infeccioso y establecer una pol tica de antibi ticos coherente y apropiada en concordancia con el centro hospitalario o el rea asistencial, lo que traer consigo una disminuci n de las infecciones nosocomiales y/o comunitarias, y una menor generaci n de resistencias en los microorganismos.

6 Para poder ser cl nicamente til, la identificaci n de un microorganismo debe ser lo m s r pida posible. La econom a y la pr ctica dictan el uso de un n mero m nimo de pruebas diagn sticas. Por necesidad, la identificaci n en Microbiolog a Cl nica representar siempre un compromiso entre la exactitud y precisi n, por una parte, y la rapidez y la econom a por otra. C mo se logra este compromiso es lo que determina la calidad diagn stica en Microbiolog a. 3. Identificaci n BACTERIANA. La taxonom a bacteriana tiene como objetivo la construcci n de sistemas que permitan clasificar a las bacterias.

7 Dentro de la clasificaci n taxon mica, las categor as y definiciones m s utilizadas son familia (un grupo de g neros relacionados entre s ), g nero (un grupo de especies relacionadas entre s ), especie (un grupo de cepas relacionadas entre s ), tipo (grupos de cepas in- terrelacionados dentro de las especies; por ejemplo, biotipo, serotipo) y cepa (aislamiento concreto de una especie en particular). Uno de los factores clave para identificar a las bacterias como agentes pat genos depende de su aislamiento en cultivo puro. Una colonia en cultivo puro est compuesta por un solo tipo de microorganismo y procede de una sola c lula original.

8 Las pruebas de identificaci n se deben hacer siempre con colonias nicas procedentes de cultivos puros. 03#Tecnicas(Lopez).indd 28 10/10/07 13:27:15. e cr tico T cnicas de identificaci n 29. La taxonom a bacteriana convencional permite la identificaci n de g neros y especies mediante la aplicaci n de diversos criterios, como los que se resumen a modo de ejemplo en la tabla 1. M todos r pidos de identificaci n bacteriana El t rmino de m todo r pido en microbiolog a engloba una amplia varie- dad de procedimientos y t cnicas que permiten obtener resultados en menos tiempo que las pruebas diagn sticas convencionales.

9 Existen m todos r pidos aplicables a la microscop a, t cnicas de identificaci n bioqu micas, pruebas de detecci n de ant genos y de anticuerpos. Incluso en las t cnicas de diagn stico molecular existe una gradaci n de celeridad, siendo algunas de estas pruebas tan r pidas como la PCR a tiempo real . Los procedimientos microsc picos que utilizan tinciones est ndar y/o anticuerpos fluorescentes para detectar microorganismos espec ficos se consi- deran m todos r pidos y se utilizan para la diferenciaci n inicial o la identifica- ci n presuntiva de ciertos grupos de microorganismos.

10 La identificaci n r pida de los cultivos cl nicos tambi n incluye equipos de identificaci n comerciales e instrumentos o sistemas rob ticos e inform ticos completamente automa- tizados. Los equipos comercializados son habitualmente sistemas de pruebas mi- niaturizadas que utilizan sustratos cromog nicos o fluorog nicos para estudiar las enzimas preformadas. Las reacciones buscadas pueden ser obtenidas en un Criterios y ejemplos metodol gicos aplicados a la identificaci n Tabla 1. bacteriana Criterio Metodolog a de ejemplo Observaci n macrosc pica Observaci n e inspecci n de colonias: disposici n, tama os, textura, formas, pigmentos, etc tera Observaci n microsc pica Tinciones: formas, agrupaci n, esporas, c psula, flagelos, etc tera Metabolismo Bater as bioqu micas: uso de sustratos (oxidaci n/fermentaci n), producci n de metabolitos secundarios, etc tera Otras propiedades Resistencia a antibi ticos.