L’isolement et la manipulation de gènes - …

1 Injection d ADN tranger dans une cellule animale Chapitre 10 L isolement et la manipulation de g nes Comment amplifier un g ne d int r t? Amplification in vivo l aide du clonage d ADN L ensemble form par un vecteur et un ou des fragments ins r s est appel ADN recombinant. Le m lange d ADN recombinant est ensuite utilis pour transformer des cellules bact riennes. En g n ral, il p n tre une seule mol cule de vecteur recombinant par cellule bact rienne. Ces cellules sont tal es et se multiplient en formant des colonies. Par cons quent, une colonie contient une population tr s importante d inserts identiques d ADN, et on appelle cette population un clone d ADN.

2 La construction de l ADN recombinant 1- Les types d ADN donneur: a) ADN g nomique b) ADN compl mentaire (ADNc) c) ADN obtenu par synth se chimique 2- Couper l ADN donneur et le vecteur l aide d enzymes de restrictions 3- Relier les mol cules d ADN (ADN donneur-vecteur) 4- Amplifier chaque ADN recombinant l aide de la machinerie bact rienne C est la d couverte et la caract risation des enzymes de restriction qui a permis le d veloppement de la technologie de l ADN recombinant. Les enzymes de restriction sont produites par des bact ries et agissent comme des ciseaux en coupant l ADN au niveau de s quences cibles sp cifiques. Exemple de coupure l aide d EcoRI: Les enzymes de restriction Enzymes qui clivent l ADN Reconnaissent des s quences nucl otidiques sp cifiques 1 re enzyme d couverte chez Haemophilus influenzae en 1970 Diff rentes enzymes sont disponibles commercialement Nomenclature.

3 BamHI B premi re lettre du genre bact rien (Bacillus) am lettres de l esp ce bact rienne (amyloliquefaciens) H repr sente la souche bact rienne (H) I premi re enzyme d couverte chez cette bact rie Fabrication d un plasmide d ADN chim rique Afin que des extr mit s collantes s associent pour former une population de mol cules chim riques, les squelettes sucre-phosphate doivent tre soud s ensemble par l utilisation de l ADN ligase qui cr e des liaisons phosphodiesters. Amplifier l ADN recombinant L ADN recombinant ligatur p n tre dans une cellule bact rienne par transformation. Apr s son entr e dans la cellule h te, le vecteur plasmidique est capable de se r pliquer car les plasmides poss dent habituellement une origine de r plication.

4 La colonie r sultante de bact ries contiendra des milliards de copies de l insert d ADN donneur de d part. Cet ensemble de copies amplifi es du fragment unique d ADN donneur constitue un clone d ADN. Choisir un vecteur de clonage 1- Les plasmides: Petites mol cules circulaires d ADN capables de r pliquer leur ADN ind pendamment du chromosome bact rien. Servent cloner des fragments d au plus 30 kb. 2- Les vecteurs viraux: Offrent de nombreux avantages pour le clonage et les applications des g nes clon s qui en d coulent. Comme l efficacit d infection des virus est lev , le g ne clon peut tre introduit dans une cellule une fr quence lev e. Servent cloner des fragments de tailles d finies.

5 3- Les cosmides: Vecteurs hybrides de phages lambda et de plasmides. Leur ADN peut se r pliquer dans la cellule comme celui d un plasmide et tre empaquet comme celui d un phage. Servent cloner des fragments d au plus 45 kb. 4- Les vecteurs large capacit : Permettent le clonage de larges fragments (maximum de 300 kb pour les BAC et de 400 kb pour les YAC). BAC: Bacterial artificial chromosome ; et YAC: Yeast artificial chromosome . 5- Les vecteurs d expression: Permettent le clonage mais aussi l expression. Choisir un vecteur de clonage -suite Un clonage dans le phage lambda Diff rents sc narios pour l entr e des mol cules recombinantes dans la cellule bact rienne Fabrication d une banque d ADN Une banque d ADN constitue l ensemble des clones obtenu partir d un seul chantillon d ADN.

6 Il existe trois types de banques d ADN: 1- Banque g nomique: Banque couvrant l ensemble du g nome. 2- Banque d ADN compl mentaire ou ADNc: Banque constitu e d ADNc, qui ne repr sentent pas n cessairement la totalit des ARNm. Il s agit plut t d une banque fabriqu e partir uniquement des r gions transcrites du g nome. 3- Banque d expression: Banque dans laquelle le vecteur porte des signaux transcriptionnels permettant n importe quel insert clon de produire un ARNm et en dernier lieu, une prot ine. Trouver des clones sp cifiques l aide de sondes Le criblage d une banque d ADN est r alis en utilisant une sonde sp cifique qui trouvera et signalera le clone que l on cherche identifier.

7 On peut soit utiliser une sonde d ADN ou une sonde qui reconna t les prot ines si un vecteur d expression est utilis et si le produit sp cifique d un g ne (prot ine) a au pr alable t isol sous forme pure, permettant le d veloppement d anticorps. Criblage d une banque d ADN phagique Le criblage destin identifier des acides nucl iques sp cifiques Les techniques de transferts de Southern et Northern peuvent galement tre utilis e pour d terminer si 1) un individu est porteur du g ne ou plus pr cis ment de l all le qui aura au pr alable t clon ou 2) d terminer si le g ne en question est exprim sous certaines conditions l tude. La compl mentation fonctionnelle On peut d tecter des clones sp cifiques dans une banque bact rienne (plasmidique) ou phagique gr ce leur capacit restaurer la fonction limin e par la mutation r cessive dans un organisme.

8 Cette proc dure s appelle la compl mentation fonctionnelle ou le sauvetage de mutants. Construire une banque bact rienne ou phagique contenant des inserts d ADN donneur recombinant de type sauvage a+ Transformer les cellules d une lign e cellulaire mutante a- en utilisant l ADN de clones individuels de la banque Identifier les clones de la banque qui produisent des cellules transform es avec le ph notype dominant a+ R cup rer le g ne a+ partir du clone phagique ou bact rien positif Amplification in vitro l aide de la r action de polym rase en cha ne Si on conna t la s quence de certaines parties du g ne ou d un fragment int ressant, on peut l amplifier en conditions in vitro dans un tube, tout cela sans clonage.

9 Cette proc dure s appelle la r action de polym rase en cha ne (PCR ou polymerase chain reaction en anglais). tapes de la r action: 1) D naturation (95 C) tape qui d nature les deux fragments d ADN 2) Hybridation (temp rature variable) tape o les amorces s hybrident leurs s quences compl mentaires 3) longation (72 C) Extension des amorces par l ADN polym rase Applications de la technologie de l ADN recombinant Le fait de disposer d un g ne isol sous la forme d un clone (ou obtenu par PCR) ouvre diverses perspectives exp rimentales: 1- On peut d terminer la s quence d ADN de ce g ne en utilisant la technique de s quen age. 2- On peut muter le g ne clon et le r introduire dans son h te d origine afin d tudier les propri t s fonctionnelles de ce g ne.

10 3- On peut l utiliser comme sonde pour la cartographie ou le diagnostic g n tique. 4- On peut introduire le g ne clon dans un nouvel h te afin de cr er un organisme transg nique (ou g n tiquement modifi ) que l on n aurait pas pu obtenir facilement la suite de proc dures standards de croisement. D terminer une s quence d ADN La s quence nucl otidique d un g ne repr sente l aboutissement de la caract risation de sa structure g n tique. Pour s quencer un ADN, il faut pouvoir en obtenir des fragments d finis. Il y a donc une forte interd pendance entre la technologie du clonage et celle du s quen age. Le principe du s quen age La technique de s quen age la plus utilis e actuellement a t d velopp e par Fred Sanger.