La Cinétique enzymatique À Un substrat

1 La Cin tique enzymatique Un substratD finition de la cin tique enzymatiqueC est l tude des vitesses de r actions et de leurs modificationsen r ponse aux changements des conditions exp rimentalesLes diff rentes phases de la r action enzymatiqueConcentrationTempsT0T1T2 Evolution de la cin tique enzymatique [S][P][ES]Les diff rentes phases de la r action enzymatiqueDiff rentesphasesPr -stationnaireStationnairePost stationnaireCaract ri-stiquesEnzyme mise en pr sence d exc s de substratCombinaison ES tr s rapideEnzyme satur e par le substratCombinaison ES est concentration maximaleConstanteVitesse de la r action est constante.

2 Vitesse initiale(Reste constante tant que le substrat est concentration saturante de l enzyme)Diminution de Sde mani re significative au bout d un temps plus au moins long selon l enzymeLes diff rentes phases de la r action enzymatiqueS : La vitesse de la r action est ind pendante de la concentration en substrat : R action d ordre 0 Faible quantit de S: La vitesse de la r action est proportionnelle la concentration en substrat : R action d ordre 1 Travailler en concentration saturante en substratD finition de la vitesse d une r action enzymatiqueS exprime par:-La quantit de substrat m tabolis par unit de tempsV= -dS / dt-Ou par la quantit de produit form par unit de tempsV= dP / dt( Dans les conditions optimales)D finition de la vitesse d une r action enzymatiqueTemps[P]Phase I: v0= dP/dtPhase II: Inflexion de la droite par.

3 -Epuisement du substrat - Inactivation de l enzyme- Formation d une grande quantit de produits, susceptible de donner la r action inverseD finition de la vitesse d une r action enzymatiqueIl est indispensableD tudier la vitesse initiale de r action dans les conditions ou la[S] [E]Si le temps de la r action est tr s court, la modification de [S] est n gligeable, et [S] peut tre consid r comme constanteInfluence de la concentration en enzyme sur la Vi E Vi Vi est proportionnelle la E dans un premier temps, puis elle demeure constante pour des concentrations enzymatiques plus lev esInfluence de la concentration en enzyme sur la concentration en produitTemps[P][E1][E2][E3]Influence de la concentration croissante du substrat sur.

4 Temps[P][S1][S2][S3]La concentration du produit form La vitesse initiale de la r actionInfluence de la concentration croissante du substrat [S] est saturante L enzyme est en plaine activit et tout les sites actifs sont satur sEn pratique,D termination d une activit enzymatique lorsque [S] est saturante (en exc s) Hypoth se de Michaelis-MentenE + S ES E + P Formation du complexe ES: E + S ES(Etape rapide et r versible) Dissociation du complexe ES: ES E + P Disparition de S Apparition de P R g n ration de E K1K2K3V1V2V3L a constante de MichaelisD apr s la loi d action de masse:V1 = k1 [E][S]V2 = k2 [ES]Vitesse d apparition des produits: dP/dt= V3= k3 [ES]La vitesse de disparition des substrat est gale la vitesse d apparition du produit-dS/dt = dP/dtLa vitesse de disparition des substrat = -dS/dt= V1-V2L a constante de MichaelisV1-V2= V3k1 [E][S]= (k2 + k3 )[ES]k2 + k3 = [E][S] =KmK1 [ES]Km.

5 Constante de dissociation du complexe ESconstante de MichaelisValeur de Km est d autant plus lev e que la:- dissociation du complexe ES est forte-Et donc que l affinit de l enzyme pour son substrat est faibleL quation de Michaelis[Et]: Concentration de l enz pr sente dans le syst me[E]=[Et]-[ES]Km = [E][S] = ([Et]-[ES]) [S][ES] [ES]Km+ [S]= [Et] [S] [ES]= [Et] [S] [ES] Km+ [S]V= vitesse de la r action enzymatique = V3V= V3= k3 [ES] V= k3 [Et] [S] Km+ [S]L quation de MichaelisLa vitesse de la r action d pend de la: concentration en enzyme totale Concentration en substrat De la constante de MichaelisLa vitesse est maximale lorsque [ES] sera la plus grande possible.

6 Lorsque la totalit de l enzyme sera combin au substrat [Et] =[ES] Vm=K3 [Et]V= Vm [S] Km+ [S]Interpr tation et int r ts 1- V= Vmax/2= Vm[S]Km+ [S]Km= [S] lorsque la vitesse de la r action est gale la moiti de la vitesse max2-Quand la concentration initiale en substrat est tr s sup rieure Km (Km n gligeable)Vi =Vm = kcat[Et] (kcatest l efficacit catalytique)3-Quand la concentration initiale en substrat est tr s inf rieure Km ([S] n gligeable)Vi =kcat /km .[Et][S] kcat/Km :la constante de sp cificit Interpr tation et int r ts Km est fonction des constantes de vitesse de chacune des tapes de la catalyse:Km= k2+k3k1Si k2 k3 : dissociation de ES est plus rapide que la formation de E et PKm= k2/k1= constante de dissociation KsKm : mesure de la stabilit du complexe ESKm lev : liaison faibleKm faible : liaison forteInterpr tation et int r ts S] << k m: V= V max.

7 S]/Km S] = k m: V= V max/2 S] k m: V= V maxM thode de d termination de la constante de Michaelis1- M thode arithm tique:V= Vmax/2 Km= [S]M thode de d termination de la constante de Michaelis2- M thode graphique de Line weaveret Burk:1 = Km 1 + 1V Vm [S] VmM thode de d termination de la constante de Michaelis2- M thode graphique d Eadie Hofstee:V = Vm - Km V[S] Pente= - kmV/ [S] Vm/ Km VmVD finition des unit s enzymatiquesUnit internationale:Quantit d enzyme capable de catalyser la transformation d une micromole de substrat par min, dans des conditions optimales de mesureUI= mol/min = Activit enzymatique = V maxUI/ unit de volumeKatal:Quantit d enzyme qui catalyse la transformation d une mole de substrat par secondeD finition des unit s enzymatiquesActivit sp cifique.

8 Nombre de mol cules de substrat transform es par min et par milligramme d enzyme mol/min = UImg de prot ine mg de prot ineMesure le degr de puret d une pr paration enzymatiqueD finition des unit s enzymatiquesActivit sp cifique mol culaire:Nombre de mol cules de substrat transform es par min et par mol cule d enzyme mol/min = UI mol de prot ine mol de prot ineD termination de l activit enzymatiqueEn cin tique:Do= . C. l C= Do. 1/ .1/lActivit enzymatique en UI/l= Do/ t.

9 1/ . 1/l . Vt/Ve .10 6 t:temps de mesure en min : coefficient d absorption molairel: trajet optiqueVt: volume du m lange r actionnel total ou se fait la mesureVe : volume du milieu contenant l enzyme doser