LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA

1 ISTITUTO TECNICO PER ATTIVIT SOCIALI GIORDANO BRUNO PERUGIALABORATORIO DI MICROBIOLOGIAR ealizzato da Massimo Trauzzola e Rossana Baglioni Realizzato da Massimo Trauzzola e Rossana Baglioni Febbraio 2008 REPERTORIO DEI MODULIE DELLE UNIT DIDATTICHE1. ALLA SCOPERTA DEI IL LABORATORIO DI MICROBIOLOGIApag. L UBIQUIT DEI MICRORGANISMIpag. 102. OSSERVARE I COLORAZIONE SEMPLICE CON BLU DI METILENEpag. COLORAZIONE NEGATIVA CON NIGROSINApag. COLORAZIONE STRUTTURALE DELLE SPOREpag. COLORAZIONE STRUTTURALE DELLA CAPSULApag. 213. LA COLTIVAZIONE DEI ALLESTIMENTO DI COLTURE BATTERICHE CON DIVERSETECNICHE DI SEMINA pag. 25 I BATTERI DELLO YOGURTpag. EFFETTO DI DIVERSI FATTORI AMBIENTALI COLORAZIONE DIFFERENZIALE DI GRAMpag. EFFETTO DI DIVERSI FATTORI AMBIENTALI SULLA CRESCITA DEI MICRORGANISMIpag. 334. CRESCITA E CONTROLLO DELLA CRESCITA DEI CONTA MICROBICA IN PIASTRApag. CONTA SU TERRENO LIQUIDOpag. CONTA PER FILTRAZIONE SU MEMBRANApag.

2 424 4 ANALISI MICROBIOLOGICA DELL ACQUA POTABILEpag 465. CARATTERISTICHE METABOLICHE DEI UTILIZZAZIONE DELL AMIDOpag. UTILIZZAZIONE DI CARBOIDRATI DIVERSIpag. OSSIDAZIONE E FERMENTAZIONEpag. 675 4 UTILIZZAZIONE DI AMINOACIDIpag ANALISI MICROBIOLOGICA DELL ACQUA POTABILEpag. VALUTAZIONE DELL AZIONE INIBENTE DI ALCUNI DISINFETTANTI DI USO COMUNEpag. ANTIBIOGRAMMApag. 566. INTERAZIONE PROTEINA C REATTIVApag. TITOLO ANTI-O-STREPTOLISINICOpag. UTILIZZAZIONE DI AMINOACIDIpag. ENTEROTUBEpag. 73 APPENDICETERRENI DI COLTURApag. 81 BIBLIOGRAFIApag. 90121. ALLA SCOPERTA DEI IL LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA3 Non portare mai nulla alla bocca (matite, pennarelli), non mangiare, bere e fumare in LABORATORIO . 3N di i bi ii li tti REGOLE GENERALI PER LA SICUREZZA3 Non sedersi sopra i banconi e non appoggiarsi agli il camice, i guanti e gli occhiali protettivi quando si eseguono operazioni pericolose. 3E compito di ciascuno mantenere i camici puliti e in buone condizioni.

3 3I capelli devono essere raccolti in modo da evitare contatti con superfici sporche o con la fiamma del lasciare mai senza controllo reazioni in corso o apparecchi in funzione. 3 Non appoggiare recipienti o apparecchi sul bordo del bancone. 3 Non portare in tasca forbici, tubi di vetro o oggetti taglienti e appuntiti. 3Il lavaggio delle mani deve essere effettuato durante e, in particolare, alla fine dell attivit lavorativa dopo la manipolazione di materiale biologico. 3Le apparecchiature di LABORATORIO devono essere sistemate e ripulite in modo corretto dopo l etichetta dei reagenti sono riportati:SIMBOLI DI PERICOLO3nome del prodotto3composizione chimica3simboli di pericolosit 3frasi di rischio e sicurezzaSIMBOLI DI PERICOLOT ossico: sostanza chimica chepu causare danni acuti ocronici all organismoInfiammabile:qualsiasisostanzal iquida, solida, vapore o gas che ossidante: sostanza ingrado di rilasciare ossigeno chepu incrementare o accellerare : sostanza chimicaEsplosivo: materiale che produce unistantaneoeimprovvisorilasciodipressio ne, gas o calore quando sottopostoadunbruscoshock.

4 Materiale non corrosivo checheprovoca distruzione visibileo alterazione irreversibile deitessuti organici nel punto effetti infiammatori reversibili suitessuti viventi attraverso l azione chimicanel punto di contatto in funzione dellaconcentrazione e del tempo di TECNICHE DI ASETTICITA Le finalit di queste tecniche sono:a)ottenere e mantenere pure le colture di microrganismib)svolgere il lavoro in LABORATORIO di MICROBIOLOGIA con sicurezzaUna coltura pura costituita solo da una specie di contaminazione delle colture a rischio in quanto i microbi si trovano ovunque, sullaqqpelle, nell aria, sulle superfici dei piani di regole fondamentali delle tecniche di asetticit sono:-usare terreni e attrezzature sterili-lavorare vicini alla fiamma del bunsen-sollevare i coperchi delle piastre Petri solo parzialmente-tenere i tappi delle provette tra le dita e non appoggiati sul banconetenere i tappi delle provette tra le dita e non appoggiati sul bancone-flambare il collo della superficie esterna delle provette prima e dopo il prelievo-arroventare le anse e gli aghi da inoculo alla fiamma per l intera lunghezza dell astina metallica, sia prima che dopo i prelievi-la fiamma del bunsen in uso deve essere ossidante, blu e alta circa 5 cm-quando il bunsen non si usa si deve lasciare la fiamma gialla, in modo da poterla vedere facilmentesterilizzare la vetreria e il materiale monouso usati dopo l uso dentro apposite buste-sterilizzare la vetreria e il materiale monouso usati.

5 Dopo luso dentro apposite buste autoclavabili -disinfettare il bancone di lavoro accuratamente -sistemare tutto il materiale utilizzato in modo correttoINCUBAZIONE DELLE COLTURES crivere sulla base della piastra Petri primadell inoculo indicando il nome dell operatore, ladata, il nome del microrganismo, in modo dariconoscere la piastra e sapere ci che colture pure in piastra devono essere sigillate connastro TECNICHE DI STERILIZZAZIONES terilizzazione: trattamento termico, chimico e gassoso per eliminare ogni forma di vita. Pu essere realizzata con:a- calore seccob- calore umidoc- filtrazioneCALORE SECCOa) aria calda La stufa a secco, utilizza temperature molto alte e serve a sterilizzare la vetreria messa in contenitori metallici o ricoperta con carta di alluminio. I parametri d uso della stufa sono:160 per 60 150 per 120 140 per 180 b) flambaturaAlla fiamma del bunsen, si pu sterilizzare la superficie esterna delle provette, o delle beute.

6 La fiamma del bunsen esercita un azione germicida nell aria intorno alla fiamma per un raggio di circa 10 cm, creando una zona ) arroventamentoAlla fiamma del bunsen, anche possibile sterilizzare l ansa o l ago prima e dopo i o spatole si sterilizzano dopo averle immerse in alcool e poi passate allaPinze o spatole si sterilizzano dopo averle immerse in alcool e poi passate alla fiamma. TEMPERATURE DELLA FIAMMA DEL BUNSEN5 CALORE UMIDOa) tindallizzazioneLa soluzione da sterilizzare viene esposta a vopore fluente ad una temperatura di 100 CLa soluzione da sterilizzare viene esposta a vopore fluente ad una temperatura di 100C con un trattamento ripetuto per 3 giorni. Il trattamento indicato per terreni nei quali possono crescere spore, le quali sfuggite al primo riscaldamento, vengono eliminate con il secondo e il ) vapore sotto pressionePer questa tecnica si usa l autoclave che unisce l azione del calore alla pressione. Il potere di penetrazione del vapore acqueo nel substrato viene aumentato.

7 La sterilizzazione viene effettuata di solito a 121 per 15 La sterilizzazione viene effettuata di solito a 121 per 15 .Tabella di sterilizzazione in autoclave:TemperaturaPressione (atm)tempo (minuti)1100,51501150,755012011512011512 51,356,5 FILTRAZIONEa) filtri milliporeSi utilizza per le sostanze che non possono essere sterilizzate a caldo (zuccheri, latte, vitamine), si usano filtri porosi di acetato di cellulosa, capaci di trattenere i batteri di grandezza superiore ai loro ) membrane filtrantiPer filtrare campioni liquidi, al fine di trattenere i batteri in esso presenti, si utilizzano opportune membrane con l apposito apparato di ) cappa a flusso laminareServe per eseguire al suo interno manipolazioniServe per eseguire al suo interno manipolazioni microbiologiche per eliminare la contaminazione dei prodotti ma anche dell operatore e dell APPARECCHIATURA DA LABORATORIOMICROSCOPIOS trumento capace di fornire un'immagine ingrandita di un piccolooggetto osservato attraverso di microscopio composto di.

8 - una parte meccanica detta stativo-unaparteotticaunaparteotticaUSO DEL MICROSCOPIO - accendere la luce- porre il vetrino sul tavolino traslatore, sistemare il preparato rivolto verso l alto e in prossimit dell apertura centrale del tavolino- avvicinare il tavolino all obiettivo pi piccolo (4x) mediante la vite macrometricafliii- mettere afuoco conlavite micrometrica- regolare l intensit della luce- regolare l apertura del diaframma considerando che con l obiettivo 100x il diaframma deve avere lamassima apertura- spostare il preparato sul tavolino mediante il sistema di viti poste al di sotto di esso- individuare un buon campo e quindi ruotare l obiettivo successivo (10x) e passare poi al 40xmantenendo sempre il fuocobblillilidilidiildl-abbassarelegger menteiltavolino traslatore, mettere unagocciadioliodaimmersione alcentrodelvetrino, abbassare l obiettivo 100x concautela verso la goccia e mettere a fuoco- descrivere quanto osservatoPRECAUZIONI D USO DEL MICROSCOPIO- non lasciare i vetrini sul tavolino traslatoretli l li d ll bi tti 100X d l t tilid l t i bt di ll-togliere l olio dall obiettivo 100X dopo averlo usato utilizzando la carta imbevuta di alcool- non far toccare gli obiettivi al preparato- non forzare alcuna manopola e non svitare gli obiettivi o gli oculariCAPPA A FLUSSO LAMINARELa cappa consente la protezione dell operatore e dell ambientedal rischio di contaminazione con batteri e permette di lavorare incondizioni di sterilit.

9 Il flusso continuo di aria sterile, all internodella cabina, impedisce la fuoriuscita verso l esterno, di microbi. Lasterilizzazione viene realizzata facendopassare l aria attraverso deifiltri. E opportuno accendere la cappa circa 20 prima di iniziare alavorare per assicurare una completa sterilit all interno della autoclave viene usata per sterilizzare terreni di coltura, soluzioni acquose eltdiifi tNldit , viene usatoilvapore adaltapressione, di solito 121 C. I microbi sieliminano meglio con il caldo umido checon quello secco della stufa, perch il vapore denatura le loro prima di tutto che ci sia acqua sufficiente che copra la serpentina dirame in modo che non scaldi a secco durante il processo. Il coperchio deve essereperfettamente chiuso prima di iniziare il ciclo di sterilizzazione, quando questo completato, si attende che l autoclave sia raffreddata prima di aprirla. L aperturaanticipata del coperchio pu causare l ebollizione dei liquidi nei D USO DELL AUTOCLAVEE sistono due fattori critici per la riuscita del processo:- tutta l aria deve fuoriuscire dall autoclave in modo tale che il vapore entri a contatto con la superficie dici che deve essere sterilizzato.

10 In caso contrario la temperatura resterebbe pi ill titihidit tiItldl i-imaterialinondevono essere sigillati,tappie coperchidevono essere appena ariacontenuta al loro interno pu uscire il tempo deve essere sufficiente per permettere al vapore di penetrare nei a circolazione d aria calda, termoregolato, che permettedi mantenere costante la temperatura. Ha un intervallo di temperaturacompresa tra 20 e 80 C. Internamente ci sono deiripiani forati perfavorire la circolazione dell colture batteriche, dopo lasemina nei terreni appositi, vengono poste ad incubare nei termostatidove la temperatura impostata a 37 in quanto ottimale per il che consente di mantenere terreni di colture a temperatura costantein bagni di acqua. Ha un intervallo di temperatura compresa tra 25 e 98 i ttiditttilhi tittAll interno contienedeiportaprovette,ilcoperchio atimpanoperpermettereall acqua di condensazione di ricadere all interno. Il bagnomaria si usa per tenerein incubazione test sierologici a 37 C e per l agar fuso pronto per l uso per lesemine in TECNICAS trumento destinato alla misura dei di pesare quantit finoa 2000 g circa, con sensibilit di centrifugazione un metodo di separzione della fase liquida nelle sospensioni,permezzodellaforzacentrifuga Lacentrifuga costituitadaunrotorepartemobile e girevole, con logge fisse per la collocazione delle provette.