LE TECNICHE DI SEMINA

1 LE TECNICHE DI SEMINA . Con il nome di SEMINA si intende l'operazione attraverso la quale si immette un inoculo (cio poche cellule vive) di un campione contente microrganismi a contatto con terreni di coltura allestiti in piastra e in provetta. L'inoculo pu essere seminato: in piastra contenete terreno solido, in provetta con terreno liquido, in provetta con terreno solidificato a becco di clarino . Dopo incubazione in termostato a 37 C per 2 3 giorni le cellule batteriche inoculate, invisibili ad occhio nudo, si saranno moltiplicate in modo tale da formare delle colonie visibili ad occhio nudo.

2 Per esercitarsi con le TECNICHE di SEMINA , ad ogni gruppo di lavoro viene assegnata una coltura batterica pura (brodocoltura starter preparata dall'insegnante), cio costituita da un unico ceppo microbico. Le colonie cresciute saranno oggetto di caratterizzazione microbica. SEMINA IN PIASTRA MEDIANTE INCLUSIONE O DIFFUSIONE. La tecnica di inclusione in piastra prevede dapprima di inoculare la piastra con il campione liquido in esame e, successivamente, di versare sopra ad esso il terreno agarizzato liquefatto e raffreddato a circa 45 50 C (non superiore altrimenti l'eccessivo calore pu uccidere le cellule batteriche).

3 In questo modo le colonie, dopo incubazione in termostato a temperatura opportuna, crescono e si sviluppano sia all'interno che sulla superficie del terreno. Se la concentrazione microbica del campione seminato non troppo elevata, si riesce ad ottenere una buona distribuzione delle colonie, cio le colonie crescono isolate le une dalle altre. In genere tale tecnica di SEMINA viene utilizzata: per studiare la morfologia della colonia, in quanto le colonie isolate sono pi facilmente osservabili, per l'analisi quantitativa, in quanto, essendo le colonie isolate e non sovrapposte, si riescono a contare (per il momento, per , questo aspetto non verr preso in considerazione), per ottenere una coltura di partenza da cui effettuare poi successivi trapianti in altri tipi di terreni (anche questo aspetto, per il momento, non verr affrontato).

4 Materiale occorrente brodocoltura starter (preparata dall'insegnante). terreno di coltura: AGAR TRIPTONE SOIA (ATS) sterile liquefatto 1 piastra Petri in plastica sterile 1 pipetta monouso in plastica da 1 mL bunsen Procedimento Lavorare con tecnica sterile: disinfettare il piano di lavoro con alcool denaturato, accendere il bunsen. Siglare la piastra. Agitare senza capovolgere (i tappi a molla non sono a tenuta ermetica!!!) la brodocoltura starter. Togliere il tappo e flambare velocemente l'imboccatura della provetta. Prelevare 0,5 mL ( 10 gocce) della brodocoltura starter e depositarla al centro della piastra sollevando leggermente il coperchio.

5 Richiudere subito il coperchio della piastra. Aprire e flambare il recipiente contenente il terreno di coltura ATS liquefatto e raffreddato a 45 50 C e versarne circa 4 5 mm sopra all'inoculo nella piastra. Richiudere, flambando, il recipiente contenente il terreno. Chiudere rapidamente la piastra e miscelare con leggero movimento rotatorio sia in senso orario che antiorario, quindi lasciare la piastra ferma e chiusa in posizione orizzontale fino a quando il terreno non si . solidificato. Rovesciare la piastra e incubare in termostato a 36 C per 48 ore.

6 SEMINA IN PIASTRA MEDIANTE STRISCIAMEN. S NTO. LLa tecnica did strisciame ento in piasstra prevede e dapprima di allestiree la piastra con il terreeno agarizzatto liquefattoo e raffredda ato a 45 500 C (non sup periore altrim menti si form ma troppa co ondensa den ntro alla piasstra quando questa vien ne chiusa coon il suo cop perchio), di lasciarlo soliidificare com mpletamentee e, successivvamente di seminare so opra la sua superficie laa coltura miicrobica in eesame mediante opporttuni movimenti sulla sup perficie del terreno sol idificato (l'aansa non de eve scalfire iil terreno, dad cui deriva il termine strisciamen nto ) dell'ansa sterile.

7 Esistonoo varie tecnicche di strisciamento su ppiastra (in se eguito sono riportate r duee modalit , ma ne esisto ono molte aaltre), aventti tutte l'ob biettivo com mune di ino oculare il terreno nel punto di inizio i con unau concentrrazione elevvata di micro organismi, chhe viene poi man mano diluita med iante opporttuni movimeenti dell'ansaa (strisciameento dell'anssa), dando coos luogo allaa formazione di colonie batteriche concentrate c nel punto dii SEMINA iniziale e poi ma an mano sem mpre pi dilu uite e ben sepparate e isolaate le une daalle altre.

8 In generale tale tecn nica di SEMINA viene utilizzzata: pper studiare la morfologia della colonnia, in quantto le colonie isolate sonoo pi facilmen nte osservab bili, pper verificarre la presenza/assenza di microrgan nismi in un campione i ncognito (pe er il momen nto, per , quuesto aspetto o non verr preso p in conssiderazione),, pper otteneree una coltura a di partenzaa da cui effeettuare poi successivi traapianti in altri tipi di terrreni (anche qquesto aspetto, per il mo omento, non verr affron ntato). Materialle occorrentee brodocoltura starter (preparata dall'insegnan d nte).

9 Terreno di coltura: AGAR TRIPTONE SOIA (ATTS) sterile liqu astre Petri in plastica sterile uefatto 2 pia 1 ansa di metallo bunsen Strisciam mento a linea continua Sterilizzare l'ansaa di metallo o per arroveentamento sulla fiamm ma del bunssen, farla raffreddare per 20 30 secondi all'aria, quiindi prelevare un'ansata a della broddocoltura starter e depositarlaa, tenendo so olo leggermeente sollevatto il coperchio, in un punnto vicino al bordoo della prima piastra Petri con terrenoo solidificato o. Stando vicino allaa fiamma de el bunsen e con il cope erchio della piastra legggermente sollevatoo, strisciare l'inoculo l disttribuendolo avanti e indiietro da un bordo b all'altrro a linee continuee e parallelee su tutta la a superficie del terrenoo, senza ma ai staccare l 'ansa.

10 Al termine,, richiudere lal piastra. mento a lineee a zig zag Strisciam . Sterilizzare l'ansa di m metallo per arroventam mento sulla fiamma del bunsen, faarla p 20 30 seecondi all'arria, quindi prelevare un 'ansata della brodocolttura raaffreddare per sttarter e depositarla, teenendo solo o leggermentte sollevato il coperchio, in un punto vicino al bordo della piast ra Petri con terreno solid dificato.. Stando vicino alla fiammma del bun nsen e con il coperchioo della piastrra leggermente so endolo avantti e indietro dda un bordo all'altro a lin ollevato, strissciare l'inocuulo distribue nee coontinue e pa arallele fino a ricoprire circa un terzo della piaastra; sterilizzare di nuo ovo l'aansa sulla fia amma e raffrreddarla, ruo uare a seminare otare la piasttra di circa 445 e continu paartendo dalll'estremit ffinale preced dente fino a ricoprire uun altro terzo della piasttra.