Les Bonnes Pratiques en HPLC t UPLCHPLC et UPLC

1 Les Bonnes Pratiques en HPLC ett UPLC. Les cl s de la r ussite pour vos analyses en HPLC. et/ou UPLC. V rifier votre configuration audio. Vous devez entendre une petite 2015 Waters Corporation 1. Les Bonnes Pratiques en HPLC ett UPLC. Les cl s de la r ussite pour vos analyses en HPLC. et/ou UPLC. Philippe Vassault Responsable Business Colonne Europe du Sud L. Laura Ch Charrier i Ing nieur Support Technique - France Posez vos questions tout moment en utilisant la boite de dialogue. 2015 Waters Corporation 2. Challenges g dans les laboratoires S'assurer et veiller l'exactitude des r sultats analytiques via une d marche d d'assurance assurance qualit . Minimiser le temps consomm dans le diagnostique de pannes instruments.

2 Travailler avec des analyses robustes qui donneront des r sultats p rennes quelques soit le technicien, le syst me, et le laboratoire. 2015 Waters Corporation 3. Resultat du sondage g d'inscription p Question 1 : Dans votre laboratoire, vous utilisez principalement Question 2 : Sur les 6 derniers mois, avez-vous rencontr des difficult s sur une de vos m thodes ? Question Q 3:Q Quelle dur e de vie de colonne,, en nombre d'injections, attendez-vous ? De 100 15 000 injections . 2015 Waters Corporation 4. Sommaire Introduction Les aspects importants consid rer pour le bon d roulement d'une analyse chromatographique : Les chantillons Les phases mobiles Le syst me La colonne La m thode 2015 Waters Corporation 5.

3 Pr paration p de l' chantillon V rifier l'absence de particules visibles apr s la dilution de l' chantillon Photo de ce que peut donner la dilution d'un d un produit fini cause d'une formulation ou d'une matrice complexe et d'une description insuffisante ou inadequate de la monographie Donepezil Tablet Formulation: Dilution en solvant, solvant agitation m canique et sonication (d'apr s la pharmacop e US). 2015 Waters Corporation 6. Les conseils pour la pr paration d' chantillons HPLC/UPLC. Une filtration syst matique : Sur filtre m compatible avec le diluent utilis . L'utilisation L' tili ti d'. d'un filt en ligne filtre li estt recommand e. d . Une centrifugation peut tre n cessaire pour enlever les microparticules.

4 Une centrifugation U t if ti de d 4000 12000 RPM pendant d t 5 30 min i permettra tt d'enlever les particules invisibles. Donepezil Tablet dilu Echantillon apr s filtration Echantillon apr s filtration pr par selon la sur m et centrifugation . monographie Particules tr s fines: 12000 RPM. SALE (tr s mauvaise) Solution trouble (toujours Solution limpide(OK). 2015 Waters Corporation mauvaise) 7. Cas des chantillons biologiques Pourquoi q des Echantillons p plus Propres p ? Eliminer les interf rences de la matrice d' chantillons Minimiser les effets de matrice o Elimination de la suppression/accroissement ionique o R duction du bruit de fond Meilleures limites de d tection sensibilit accrue Moins de variabilit dans les r sultats obtenus Plus robustes entre les diff rentes matrices d' chantillons Plasmas provenant de diff rents sujets ou esp ces Gagner G en sensibilit.

5 Ibilit . Minimiser l'encrassement du syst me et le la colonne 2015 Waters Corporation 8. Solutions de p pr paration p d' chantillon Sirocco: Pr cipitation de prot ines rapide et simple Echantillon filtr s Niveau de propre Ostro: Enl ve les prot ines et les phospholipides Combinaison d'une Pr cipitation/filtration (pour les port ines) et d'une interaction sur sorbent (pour les phospholipides). et croissant Des chantillons biologiques plus propres rapidement Oasis: Sorbent polym rique pour de la SPE. Disponible en diff rents formats et diff rentes chimies Plus sp cifique pour des chantillons plus propres. 2015 Waters Corporation 9. Recommandations Phases mobiles Utiliser des solvants, tampons et additifs de haute qualit.

6 Solvants organiques : Qualit High Grade LC ou LC/MS, ne pas les filtrer JT Baker, Biosolve, Fisher Optima LC/MS Grade L'eau L eau : L'eau Milli-Q est filtr e travers une membrane m, pas besoin de la refiltrer. Les tampons p et r actifs compatibles p LC/MS. / n'ont p pas besoin d' tre re- filtr s. Changer les phases aqueuses chaque jour (UPLC) ou tous les 2 jours (HPLC). Ne pas transf rer les nouveaux solvants aqueux dans la bouteille d j en utilisation. 2015 Waters Corporation 10. Pr cautions prendre pour les phases mobiles Toutes les bouteilles doivent tre ferm es Ne N pas utiliser tili d du P. Parafilm fil pour couvrir i les l bouteilles b t ill o il peut se dissoudre et cr er un pic parasite.

7 Utiliser des bouteilles avec une certaine qualit de verre en verre borosilicate pour les phases mobiles haut pH. Utiliser de la verrerie propre (pour les bouteilles et la filtration). Ne pas les laver au lave-vaisselle et utiliser des d tergents 2015 Waters Corporation 11. Contamination bact rienne : source de probl me en UPLC comme en HPLC. p La contamination bact rienne est une source classique de bouchage de colonne en UPLC, mais peut aussi l' tre en HPLC. Faire attention aux lignes 100% aqueuses : Pr parer les phases 100% aqueuse quotidiennement. o Note: Les filtres en lignes peuvent laisser passer certaines bact ries. Meilleure solution : o En gradient: ajoutez 5 10% de solvant organique dans la bouteille contenant la phase aqueuse et modifier le gradient en cons quence.

8 O En isocratique: pr m langez la phase mobile avec ll'organique organique n cessaire. Nettoyez r guli rement les cr pines 2015 Waters Corporation 12. Autres sources de contamination Pr parez et manipulez les chantillons proprement : Utilisez des vials un niveau de certification adapt . votre d tection et l'application : Vial selector Filter Selector . 2015 Waters Corporation 13. Trucs et Astuces CERTIFIED Containers Qu'est ce que c'est ? Un kit de bouteilles certifi s pour une faible concentration TOC (Carbone Organique Total). o <15ppb TOC : les bouteilles ne contiennent pas de contaminants organiques o Pour P viter it les l probl mes bl de d pics i fant mes. f t . Waters Certified Container Low Volume Kit R f rence 186007278.

9 5 Bouteilles de 250 mL. 1 Bouteille de 500 mL. 1 kit de bouchons Trouver les sources d'une contamination est consommateur de temps Utiliser des contenants Ultra-Clean est un l ment cl permettant d'obtenir des r sultats fiables 2015 Waters Corporation 14. Dysfonctionnements y li s aux colonnes Colonne endommag e Hydrolyse y y du ligand g Vide Bouchage Temps d' quilibration/r quilibration insuffisant 10 volumes de colonnes pour une bonne quilibration Interactions secondaires Interactions ioniques Interaction m talliques Variabilit de fabrication 2015 Waters Corporation 15. What makes an LC column reproducible? A) Sorbents B) Packing C) Engineering 25. 1 . 7 m ACQUITY UPLC BEH C18.

10 2 . 5 m XBridge BEH C18 XP. 20. 2 . 6 m Core Shell C18. Plate Height ((H, 4 sigma). 15. 10. 5. Acenaphthene, x 50 mm columns 70/30 MeCN/H2 O, 30 C, 254 nm 0. Linear Velocity, u (cm/sec). All are CRITICAL! 2015 Waters Corporation 16. Effet d'un vide p pr sent dans la colonne Colonne bien remplie Colonne avec un espace vide Changement de forme de pic Changement de sensibilit . Changement de r solution 2015 Waters Corporation 17. Trucs est Astuces Recommandations Colonnes Une colonne d j utilis e peut avoir t alt r e chimiquement Lors de l'utilisation d'une nouvelle colonne, si la colonne a t . alt r e, les r sultats seront diff rents. Pour viter d'avoir d avoir refaire un d veloppement Toujours utiliser une Colonne neuve lors d'un d veloppement de m thode 2015 Waters Corporation 18.)