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Métodos de separación Cromatografía: definición y ...

Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco Facultad de Ciencias Naturales y Ciencias de la Salud. C tedra: Qu mica Biol gica I A o 2018 1 M todos de separaci n Cromatograf a: definici n y clasificaci n La cromatograf a es una t cnica en la cual los componentes de una mezcla se separan a partir de las diferencias de velocidad a la que son transportadas a trav s de una fase fija o estacionaria por una fase m vil gaseosa o liquida. Su nombre significa escribir con color ya que la cromatograf a fue empleada por primera para separar pigmentos. Existen numerosas variantes del m todo, pero el fundamento es com n a todos los m todos: Una Fase M vil se mueve a trav s de una Fase Estacionaria arrastrando en su camino las mol culas de una muestra.

Cromatografía en capa fina (TLC) La cromatografía en capa fina ( thin layer chromatography) es una técnica de reparto en la que resultan muy importantes las interacciones por adsorción. La TLC utiliza como soportes el gel de sílice, la celulosa, las poliaminas, el gel de óxido de aluminio y el gel de silicato magnésico.

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1 Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco Facultad de Ciencias Naturales y Ciencias de la Salud. C tedra: Qu mica Biol gica I A o 2018 1 M todos de separaci n Cromatograf a: definici n y clasificaci n La cromatograf a es una t cnica en la cual los componentes de una mezcla se separan a partir de las diferencias de velocidad a la que son transportadas a trav s de una fase fija o estacionaria por una fase m vil gaseosa o liquida. Su nombre significa escribir con color ya que la cromatograf a fue empleada por primera para separar pigmentos. Existen numerosas variantes del m todo, pero el fundamento es com n a todos los m todos: Una Fase M vil se mueve a trav s de una Fase Estacionaria arrastrando en su camino las mol culas de una muestra.

2 Estas interaccionan de forma diferentes con las fases, por lo cual algunas avanzan r pido y otras m s lento, logrando as la separaci n . Los m todos cromatogr ficos pueden ser clasificados seg n: El estado f sico de la fase: Seg n el estado de las fases tenemos que la fase m vil puede ser un gas o un l quido, mientras que la estacionaria puede ser un l quido o un s lido. Se pueden establecer cuatro tipos de cromatograf a: gas-l quido, l quido-l quido, gas-s lido, l quido-s lido. El mecanismo de separaci n: Existen numerosos mecanismos de interacci n entre los componentes de la mezcla y las fases del sistema cromatogr fico.

3 En algunos casos participan m s de un mecanismo en un mismo proceso de separaci n por lo que dificulta la clasificaci n. Los principales mecanismos que intervienen en la separaci n cromatograf ca son: de reparto, adsorci n, exclusi n molecular, de afinidad e intercambio i nico. Se relacionan con las propiedades f sicas de las biomol culas a separar: solubilidad, tama o, carga, hidrofobicidad, interacciones por afinidad biol gica, interacciones inespec ficas. El tipo de soporte: Respecto al soporte son varias las formas que existen, se llama soporte inerte (silica gel) si no participa en la separaci n y soporte activo (papel) si participa en el proceso de separaci n.

4 Tambi n es importante definir la geometr a del soporte a utilizar, aqu se introduce el concepto de cromatograf a planar o en Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco Facultad de Ciencias Naturales y Ciencias de la Salud. C tedra: Qu mica Biol gica I A o 2018 2 columna. Los m todos cromatogr ficos son de dos tipos. En la cromatograf a en columna, la fase estacionaria est contenida en un tubo estrecho y se fuerza el paso de la fase m vil a trav s del tubo, ya sea por presi n o por gravedad. En la cromatograf a planar la fase estacionaria esta sostenida sobre una placa plana o en los poros de un papel, aqu la fase m vil se desplaza a trav s de la fase estacionaria por capilaridad o por efecto de la gravedad.

5 La direcci n de la corrida: ascendente, descendente o bidireccional. Objetivo de la utilizaci n de un m todo cromatogr fico: Separaci n preparativa (separar los componentes de una mezcla) o anal tica (cualitativa: identificaci n y an lisis de pureza; o cuantitativa). Principio de Adsorci n Gases o l quidos contenidos en la fase m vil son retenidos por una adsorci n selectiva en la superficie del s lido (s lice o de al mina) que constituye la fase estacionaria. Este mecanismo controla la cromatograf a gas-s lido y l quido-s lido. La muestra aplicada en la capa es adsorbida en la superficie del material por la acci n de fuerzas electrost ticas (fuerzas de Vander Waals, puentes de Hidr geno, efectos inductivos, etc.)

6 Los disolventes m s empleados son el ter de petr leo, el ter et lico, la acetona, el benceno, el metanol, el etanol y el agua. (Tambi n se pueden utilizar mezclas de solventes para lograr la polaridad deseada). Ejemplo: separaci n de 17-hidroxicorticoides en orina. Posterior cuantificaci n colorim trica o por fluorimetria. Principio de Reparto Los componentes de la fase m vil son retenidos por la fase estacionaria liquida en funci n de su solubilidad en ella. Si las dos son l quidas se tiene un proceso de extracci n en continuo. En una cromatograf a en donde ambas fases son liquidas, la separaci n de compuestos es en funci n de su reparto entre un fase liquida m vil y una fase estacionaria liquida adherida a la superficie interna de un soporte solido (ambas fases inmiscibles entre s ).

7 Aqu se incluyen la cromatograf a liquida de fase normal, que usa un l quido polar como fase estacionaria y la cromatograf a liquida de fase invertida, que usa una fase estacionaria apolar. Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco Facultad de Ciencias Naturales y Ciencias de la Salud. C tedra: Qu mica Biol gica I A o 2018 3 Cromatograf a en papel En esta cromatograf a se utiliza el fen meno de partici n en donde la fase estacionaria se halla sobre un soporte activo (el papel) que en realidad forma parte de la fase estacionaria que es el agua. Las fases m vil y estacionaria estar n en contacto en una gran interface, lo que permite una r pida obtenci n de una distribuci n de equilibrio del soluto entre ellas.

8 Si la muestra problema est formada por m s de un soluto, stos se separan por sus diferentes coeficientes de partici n. En la este tipo de cromatograf a el agua retenida entre las fibras de celulosa act a como fase estacionaria (polar), mientras que la fase m vil (menos polar) es una mezcla de disolventes org nicos y acuosos. La mezcla de las sustancias que hay que separar se aplica pr xima a uno de los extremos de una tira de papel adecuado. El extremo del papel que tiene cerca la aplicaci n de la muestra se introduce en el l quido de desarrollo. Las sustancias m s solubles en la fase estacionaria se mueven m s lentamente en el papel que las m s solubles en la fase m vil.

9 La cromatograf a en papel puede ser ascendente o descendente, seg n de que la fase m vil ascienda por capilaridad o descienda por gravedad y capilaridad a lo largo del soporte. Una vez desarrollada la cromatograf a, las sustancias separadas se localizan por su color, si son coloreadas, o se revelan, pulverizando sobre el papel un reactivo que reacci n con las sustancias dando un producto coloreado. Suele utilizarse para la separaci n de compuestos muy polares o poli funcionales como amino cidos, azucares y pigmentos naturales, sustancias de bajo peso molecular. Debido a sus tiempos de desarrollo largos, en la actualidad su empleo es muy reducido.

10 La realizaci n de la cromatograf a en papel implica la siembra de la muestra problema en un soporte de papel de buena calidad, en general Whatman N 1 para cromatograf a anal tica, que luego se introducir en una cuba de desarrollo de modo que el solvente (fase m vil) ascienda por capilaridad (t cnica ascendente) o descienda por capilaridad y gravedad (t cnica descendente). La fase estacionaria es un complejo celulosa - agua que tiene un poder diferente que el del agua pura. Etapas de la cromatograf a en papel Siembra: Se aplican muestras en soluci n a no menos de 1,5 cm del borde inferior de una tira rectangular de papel, y a no menos de 1,5 cm Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco Facultad de Ciencias Naturales y Ciencias de la Salud.


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