Transcription of Métodos de separación Cromatografía: definición y ...
1 Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco Facultad de Ciencias Naturales y Ciencias de la Salud. C tedra: Qu mica Biol gica I A o 2018 1 M todos de separaci n Cromatograf a: definici n y clasificaci n La cromatograf a es una t cnica en la cual los componentes de una mezcla se separan a partir de las diferencias de velocidad a la que son transportadas a trav s de una fase fija o estacionaria por una fase m vil gaseosa o liquida. Su nombre significa escribir con color ya que la cromatograf a fue empleada por primera para separar pigmentos. Existen numerosas variantes del m todo, pero el fundamento es com n a todos los m todos: Una Fase M vil se mueve a trav s de una Fase Estacionaria arrastrando en su camino las mol culas de una muestra.
2 Estas interaccionan de forma diferentes con las fases, por lo cual algunas avanzan r pido y otras m s lento, logrando as la separaci n . Los m todos cromatogr ficos pueden ser clasificados seg n: El estado f sico de la fase: Seg n el estado de las fases tenemos que la fase m vil puede ser un gas o un l quido, mientras que la estacionaria puede ser un l quido o un s lido. Se pueden establecer cuatro tipos de cromatograf a: gas-l quido, l quido-l quido, gas-s lido, l quido-s lido. El mecanismo de separaci n: Existen numerosos mecanismos de interacci n entre los componentes de la mezcla y las fases del sistema cromatogr fico.
3 En algunos casos participan m s de un mecanismo en un mismo proceso de separaci n por lo que dificulta la clasificaci n. Los principales mecanismos que intervienen en la separaci n cromatograf ca son: de reparto, adsorci n, exclusi n molecular, de afinidad e intercambio i nico. Se relacionan con las propiedades f sicas de las biomol culas a separar: solubilidad, tama o, carga, hidrofobicidad, interacciones por afinidad biol gica, interacciones inespec ficas. El tipo de soporte: Respecto al soporte son varias las formas que existen, se llama soporte inerte (silica gel) si no participa en la separaci n y soporte activo (papel) si participa en el proceso de separaci n.
4 Tambi n es importante definir la geometr a del soporte a utilizar, aqu se introduce el concepto de cromatograf a planar o en Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco Facultad de Ciencias Naturales y Ciencias de la Salud. C tedra: Qu mica Biol gica I A o 2018 2 columna. Los m todos cromatogr ficos son de dos tipos. En la cromatograf a en columna, la fase estacionaria est contenida en un tubo estrecho y se fuerza el paso de la fase m vil a trav s del tubo, ya sea por presi n o por gravedad. En la cromatograf a planar la fase estacionaria esta sostenida sobre una placa plana o en los poros de un papel, aqu la fase m vil se desplaza a trav s de la fase estacionaria por capilaridad o por efecto de la gravedad.
5 La direcci n de la corrida: ascendente, descendente o bidireccional. Objetivo de la utilizaci n de un m todo cromatogr fico: Separaci n preparativa (separar los componentes de una mezcla) o anal tica (cualitativa: identificaci n y an lisis de pureza; o cuantitativa). Principio de Adsorci n Gases o l quidos contenidos en la fase m vil son retenidos por una adsorci n selectiva en la superficie del s lido (s lice o de al mina) que constituye la fase estacionaria. Este mecanismo controla la cromatograf a gas-s lido y l quido-s lido. La muestra aplicada en la capa es adsorbida en la superficie del material por la acci n de fuerzas electrost ticas (fuerzas de Vander Waals, puentes de Hidr geno, efectos inductivos, etc.)
6 Los disolventes m s empleados son el ter de petr leo, el ter et lico, la acetona, el benceno, el metanol, el etanol y el agua. (Tambi n se pueden utilizar mezclas de solventes para lograr la polaridad deseada). Ejemplo: separaci n de 17-hidroxicorticoides en orina. Posterior cuantificaci n colorim trica o por fluorimetria. Principio de Reparto Los componentes de la fase m vil son retenidos por la fase estacionaria liquida en funci n de su solubilidad en ella. Si las dos son l quidas se tiene un proceso de extracci n en continuo. En una cromatograf a en donde ambas fases son liquidas, la separaci n de compuestos es en funci n de su reparto entre un fase liquida m vil y una fase estacionaria liquida adherida a la superficie interna de un soporte solido (ambas fases inmiscibles entre s ).
7 Aqu se incluyen la cromatograf a liquida de fase normal, que usa un l quido polar como fase estacionaria y la cromatograf a liquida de fase invertida, que usa una fase estacionaria apolar. Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco Facultad de Ciencias Naturales y Ciencias de la Salud. C tedra: Qu mica Biol gica I A o 2018 3 Cromatograf a en papel En esta cromatograf a se utiliza el fen meno de partici n en donde la fase estacionaria se halla sobre un soporte activo (el papel) que en realidad forma parte de la fase estacionaria que es el agua. Las fases m vil y estacionaria estar n en contacto en una gran interface, lo que permite una r pida obtenci n de una distribuci n de equilibrio del soluto entre ellas.
8 Si la muestra problema est formada por m s de un soluto, stos se separan por sus diferentes coeficientes de partici n. En la este tipo de cromatograf a el agua retenida entre las fibras de celulosa act a como fase estacionaria (polar), mientras que la fase m vil (menos polar) es una mezcla de disolventes org nicos y acuosos. La mezcla de las sustancias que hay que separar se aplica pr xima a uno de los extremos de una tira de papel adecuado. El extremo del papel que tiene cerca la aplicaci n de la muestra se introduce en el l quido de desarrollo. Las sustancias m s solubles en la fase estacionaria se mueven m s lentamente en el papel que las m s solubles en la fase m vil.
9 La cromatograf a en papel puede ser ascendente o descendente, seg n de que la fase m vil ascienda por capilaridad o descienda por gravedad y capilaridad a lo largo del soporte. Una vez desarrollada la cromatograf a, las sustancias separadas se localizan por su color, si son coloreadas, o se revelan, pulverizando sobre el papel un reactivo que reacci n con las sustancias dando un producto coloreado. Suele utilizarse para la separaci n de compuestos muy polares o poli funcionales como amino cidos, azucares y pigmentos naturales, sustancias de bajo peso molecular. Debido a sus tiempos de desarrollo largos, en la actualidad su empleo es muy reducido.
10 La realizaci n de la cromatograf a en papel implica la siembra de la muestra problema en un soporte de papel de buena calidad, en general Whatman N 1 para cromatograf a anal tica, que luego se introducir en una cuba de desarrollo de modo que el solvente (fase m vil) ascienda por capilaridad (t cnica ascendente) o descienda por capilaridad y gravedad (t cnica descendente). La fase estacionaria es un complejo celulosa - agua que tiene un poder diferente que el del agua pura. Etapas de la cromatograf a en papel Siembra: Se aplican muestras en soluci n a no menos de 1,5 cm del borde inferior de una tira rectangular de papel, y a no menos de 1,5 cm Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco Facultad de Ciencias Naturales y Ciencias de la Salud.