PCR (Polymerase Chain Reaction - OpenLAB

1 Ecole Doctorale Sciences de la Vie et Sant ULP Op ration OpenLAB 1 PCR (Polymerase Chain Reaction ) DEFINITION En 1983, Karry Mullis met au point une technique d amplification de l ADN: la PCR (Polymerase Chain Reaction ou R action de Polym risation en Cha ne). Aujourd hui c est une technique incontournable et couramment utilis e en routine dans les laboratoires. En deux mots, c est une r action enzymatique qui permet de s lectionner puis d amplifier en une tr s grande quantit un fragment d ADN particulier, pr sent en tr s faible quantit au d part, parmi des millions d autres fragments. PRINCIPE La PCR est une suite de cycles, qui se r p tent en boucle, comportant chacun trois paliers de temp rature. De plus, chacun de ces paliers est caract ris pas une r action chimique distincte. En moyenne une PCR comporte entre 20 et 40 cycles.

2 Les acteurs de la PCR sont: 1. L ADN Avant la r action de PCR, l ADN est extrait partir de l chantillon que l on veut analyser (salive, cheveux, cellules, ). Puis, cet extrait purifi en ADN, contenant le fragment d ADN que l on souhaite amplifier, peut tre utilis en PCR. 2. Les deux amorces Ce sont des fragments courts d'ADN, capables de s'hybrider de fa on sp cifique, gr ce la compl mentarit des bases, sur l un des deux brins d'ADN. Ecole Doctorale Sciences de la Vie et Sant ULP Op ration OpenLAB 2 Les amorces sont choisies de fa on encadrer la s quence d'ADN amplifier. La taille de ces amorces est g n ralement d une vingtaine de d soxyribonucl otides. De plus, les amorces sont en tr s forte concentration par rapport celle de l ADN amplifier. Amorce 1 (CFTR 1)Amorce 2 (CFTR 2) 3. Les D soxyriboNucl otides-Tri-Phosphates (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Les dNTPs (D soxyribonucl otides-Tri-Phosphates) sont des mol cules de base, qui constituent l ADN, utilis s par la Taq polym rase pour la synth se du nouveau brin d ADN compl mentaire.

3 4. L enzyme, Taq polym rase L enzyme utilis e est une polym rase, c'est- -dire qu elle peut synth tiser un nouveau brin d ADN partir du brin d ADN matrice apr s s tre fix e une amorce. 5. Le milieu r actionnel Le milieu r actionnel de la PCR comporte l ADN amplifier, les dNTPs, les deux amorces, la Taq polym rase, un tampon et des ions magn sium (MgCl2). Ces deux derniers composants d finissent un milieu avec un pH optimal et une concentration saline optimale pour le bon fonctionnement de l enzyme. LA Reaction La PCR est une technique automatis e. En effet, la r action de PCR se fait dans un thermocycleur. L appareil contient un bloc chauffant o l on ins re les tubes contenant notre m lange pour la r action de PCR et o la temp rature peut varier tr s rapidement et tr s pr cis ment de 0 C 100 C. Ecole Doctorale Sciences de la Vie et Sant ULP Op ration OpenLAB 3 Le thermocycleur est alors programm pour effectuer les diff rents cycles de la PCR.

4 Ainsi, chaque cycle est compos d une succession de paliers de temp rature pr d termin e, et d une dur e bien d finie. Ces deux param tres, temp rature et temps, d pendent de la taille de la s quence amplifier de la taille et de la composition en d soxyribonucl otides des amorces. Bloc chauffant Clavier pour la programmation des cycles Petite anecdote: Il faut savoir qu au d but des ann es 80, les chercheurs n avaient pas encore de thermocycleur dans leur laboratoire et pour changer la temp rature, ils devaient passer les tubes d un bain-marie l autre. Je vous laisse imaginer le temps que cela prenait !! Chaque cycle est donc constitu de trois p riodes diff rentes: 1 3 2 D naturation Hybridation Elongation Ecole Doctorale Sciences de la Vie et Sant ULP Op ration OpenLAB 4 Sch ma de la PCR Temp ratureTempsCycle 1 Cycle 2 Cycle 3 Cycle 4N cycles123 Cycle 301 copie109copiesdNTPsPolym raseAmorcesMatrice ADN+++ La d naturation: 1La temp rature dans le tube est r gl e 95 C.

5 A ce moment l , l ADN se d nature. En effet, l ADN perd sa structure caract ristique en double h lice, les liaisons hydrog ne reliant les bases de chaque brin d ADN tant instables cette temp rature. L ADN double-brin (2 brins) est d natur en ADN simple brin (1 brin). Ecole Doctorale Sciences de la Vie et Sant ULP Op ration OpenLAB 595 C25 C1 ADN double-brin 2 brins d ADN simple-brin L hybridation: 2 Ensuite la temp rature est descendue la temp rature dite d hybridation. Cette derni re est g n ralement comprise entre 50 C et 60 C et elle est fonction de la composition en d soxyribonucl otides (dATP, dTTP, dGTP, et dCTP) des amorces. Les amorces reconnaissent et se fixent leurs s quences compl mentaires en reformant des liaisons hydrog ne. On dit que les amorces s hybrident au brin d ADN.

6 Ecole Doctorale Sciences de la Vie et Sant ULP Op ration OpenLAB 6 Amorce 1 Amorce 2 Entre50 C et 60 C2 L longation: Puis la temp rature est r gl e 72 C, temp rature id ale pour l activit de la Taq polym rase. 3 C est une enzyme tr s sp ciale, puisqu elle est dite thermor sistante. En effet, sa temp rature optimale d'action est de 72 C et elle est capable de r sister des temp ratures allant jusqu 100 C. Cette Taq polym rase est extraite d une bact rie extr mophile, Thermus aquaticus, qui ne vit que dans les sources chaudes. En effet, c est en 1969 que Thomas Brock d couvre cette bact rie thermophile, dans le plus grand geyser du monde, le Steamboat Geyser, au parc de Yellowstone aux Etats-Unis. 72 C3 Amorce 1 Amorce 2 Taq polym rasedNTPs Cette tape permet la Taq polym rase de synth tiser le brin compl mentaire l ADN matrice, gr ce aux dNTPs libres pr sents dans le milieu r actionnel.

7 Ecole Doctorale Sciences de la Vie et Sant ULP Op ration OpenLAB 7Au cycle suivant, les nouveaux fragments synth tis s servent leur tour de matrice pour la synth se de nouveaux fragments d ADN. En th orie, la fin de chaque cycle la quantit d ADN cible est doubl e. Le premier cycle est fini et voil qu un nouveau cycle recommence. Cela se reproduira 30 fois (en fonction du protocole de PCR) comme vous pouvez le voir sur le sch ma. A partir d une copie d ADN cible, on pourra donc obtenir 1 milliard de copie d ADN cible. Ecole Doctorale Sciences de la Vie et Sant ULP Op ration OpenLAB Applications de la PCR: La PCR est tr s couramment utilis e dans de nombreux domaines: En m decine: pour diagnostiquer des maladies g n tiques (myopathie, mucoviscidose, etc), des infections virales (SIDA, H patite C, SRAS), bact riennes (tuberculose) ou parasitaires (toxoplasmose), mais aussi des cancers.

8 En recherche fondamentale: Multiples applications routini res. En m decine l gale: pour identifier une personne par son empreinte g n tique dans le cadre d une enqu te judicaire, pour un test de paternit . En agroalimentaire: pour identifier des vari t s ou des esp ces v g tales et animales, pour s lectionner de nouvelles vari t s de fruits et l gumes, comme la tomate pour le contr le de la qualit des produits agroalimentaires, d tecter la pr sence d OGM dans un aliment par exemple. En histoire: pour des tudes phylog n tiques sur des squelettes fossiles (ADN fossile), rechercher les liens de parent entre les individus (cas les plus c l bres: les enfants de Louis XVII, ou ceux du tsar Nicolas II) 1 Ecole Doctorale Sciences de la Vie et Sant ULP Op ration OpenLAB pour l tude des migrations des populations humaines et animales (en Islande, les indiens d Am rique), pour la d tection d infections virales, bact riennes et parasitaires sur des momies gyptiennes et andines (par exemple H-C Li et son quipe ont montr la pr sence du virus HTLV-1, l origine du SIDA, dans des momies de la Cordill re des Andes datant de plus de 1500 ans).

9 D tection d OGM dans les aliments: Un OGM est un organisme g n tique modifi . C est un organisme dont le patrimoine g n tique a t modifi par ajout d un g ne ou plusieurs g nes particuliers, conf rant ainsi l organisme de nouvelles caract ristiques (par exemple le g ne de r sistance un herbicide ou un parasite). Ces g nes ajout s sont appel s des transg nes. Des laboratoires se sont sp cialis s dans la recherche d OGM dans de nombreux produits la base de notre alimentation (ma s, soja, farine, semoule, gluten, corn flakes, amidons et d riv s, extrait prot ique, sirop de glucose, lait de soja, tourteau, l cithine, etc ..). Apr s avoir extrait l ADN des produits ils font plusieurs PCR en utilisant diff rents couple d amorces sp cifiques pour un transg ne connu. Si le transg ne n est pas pr sent dans le produit, les amorces ne s hybrident pas sur l ADN et la PCR est n gative.

10 Au contraire, si le transg ne est pr sent, il sera d tectable par l obtention d un produit d amplification et la PCR est positive. En m decine: L utilisation de la PCR dans les laboratoires de diagnostic mol culaire se fait de mani re routini re. 2 Ecole Doctorale Sciences de la Vie et Sant ULP Op ration OpenLAB En canc rologie, le but est de d tecter des mutations connues dans certains g nes sp cifiques du cancer. Cette technique de diagnostic sous-entend que l on connaisse le g ne qui est d ficient, les diff rentes mutations possibles, qui sont alors responsables d un type de cancer. Par exemple de nombreuses recherches ont t faites sur le cancer du sein (g nes BRCA1 et BRCA2), de la prostate ou de la thyro de. On sait maintenant que les mutations dans le g ne BRCA1 sont les plus fr quentes et pr disposent la majorit des cancers familiaux du sein et de l ovaire.