PRINSIP UMUM DAN PELAKSANAAN POLYMERASE CHAIN …

1 Unitas, Vol. 9, No. 1,September 2000 - Pebruari 2001, 17-29 PRINSIP umum DAN PELAKSANAANPOLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)[General Principles and Implementation of PolymeraseChain Reaction]Darmo Handoyo dan Ari RudiretnaPusat Studi Bioteknologi Universitas SurabayaAbstractPolymerase CHAIN Reaction (PCR) is an in vitro technique for the ampli-fication of a specific DNA region without prior transfer into living cells. Itis a powerful technique because a million-fold amplification can be achievedonly in a few hours. For the carrying out of PCR, pair of primers are neededthat flank the DNA region to be amplified. A primer is an oligonucleotidewith a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence inthe DNA template.

2 This paper will discuss the general principles of PCR,the detailed procedure for carrying out the PCR and the various factorsaffecting the optimal PCR results. This technique was introduced by KaryMullis in 1985, for which he obtained the Nobel Prize in : PCR; DNA amplification; primersPENDAHULUANP olymerase CHAIN Reacton (PCR) adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasiDNA secara in vitro. Teknik ini pertama kali dikembangkan oleh Karry Mullispada tahun 1985. Teknik PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi segmenDNA dalam jumlah jutaan kali hanya dalam beberapa jam. Dengan diketemukannyateknik PCR di samping juga teknik-teknik lain seperti sekuensing DNA, telah1818181818 Darmo Handoyo, Ari Rudiretnamerevolusi bidang sains dan teknologi khususnya di bidang diagnosa penyakitgenetik, kedokteran forensik dan evolusi umum PCRK omponen- komponen yang diperlukan pada proses PCR adalah templatDNA; sepasang primer, yaitu suatu oligonukleotida pendek yang mempunyaiurutan nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat;dNTPs (Deoxynucleotide triphosphates); buffer PCR; magnesium klorida (MgCl2)dan enzim polimerase PCR melibatkan beberapa tahap yaitu: (1) pra-denaturasi DNAtemplat; (2) denaturasi DNA templat.

3 (3) penempelan primer pada templat(annealing); (4) pemanjangan primer (extension) dan (5) pemantapan (post-extension). Tahap (2) sampai dengan (4) merupakan tahapan berulang (siklus),di mana pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah DNA. Tahapan proses PCRdapat dilihat pada gambar adalah suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang berulang(siklus) dan pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target DNA untaiganda. Untai ganda DNA templat (unamplified DNA) dipisahkan dengandenaturasi termal dan kemudian didinginkan hingga mencapai suatu suhutertentu untuk memberi waktu pada primer menempel (anneal primers) padadaerah tertentu dari target DNA. Polimerase DNA digunakan untuk memperpanjangprimer (extend primers) dengan adanya dNTPs (dATP, dCTP, dGTP dandTTP) dan buffer yang sesuai.

4 Umumnya keadaan ini dilakukan antara 20 40 siklus. Target DNA yang diinginkan (short target product) akan meningkatsecara eksponensial setelah siklus keempat dan DNA non-target (long prod-uct) akan meningkat secara linier seperti tampak pada bagan di atas (Newtonand Graham, 1994).Jumlah kopi fragmen DNA target (amplicon) yang dihasilkan pada akhirsiklus PCR dapat dihitung secara teoritis menurut rumus:1919191919 PRINSIP umum dan PELAKSANAAN POLYMERASE CHAIN Reaction (PCR)Gambar 1. Bagan Proses POLYMERASE CHAIN Reaction2020202020 Darmo Handoyo, Ari RudiretnaY = (2n 2n)XY : jumlah ampliconn : jumlah siklusX : jumlah molekul DNA templat semulaJika X = 1 dan jumlah siklus yang digunakan adalah 30, maka jumlahamplicon yang diperoleh pada akhir proses PCR adalah x 109.

5 Darifenomena ini dapat terlihat bahwa dengan menggunakan teknik PCR dimungkinkanuntuk mendapatkan fragmen DNA yang diinginkan (amplicon) secara eksponensialdalam waktu relatif jumlah siklus yang digunakan pada proses PCR adalah 30siklus. Penggunaan jumlah siklus lebih dari 30 siklus tidak akan meningkatkanjumlah amplicon secara bermakna dan memungkinkan peningkatan jumlahproduk yang diingat bahwa di dalam proses PCR effisiensi amplifikasi tidakterjadi 100 %, hal ini disebabkan oleh target templat terlampau banyak, jumlahpolimerase DNA terbatas dan kemungkinan terjadinya reannealing PCRU ntuk melakukan proses PCR diperlukan komponen-komponen sepertiyang telah disebutkan di atas.

6 Pada bagian ini akan dijelaskan secara rincikegunaan dari masing-masing komponen Templat DNAF ungsi DNA templat di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan untukpembentukan molekul DNA baru yang sama. Templat DNA ini dapat berupa2121212121 PRINSIP umum dan PELAKSANAAN POLYMERASE CHAIN Reaction (PCR)DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA apapun asal di dalamDNA templat tersebut mengandung fragmen DNA target yang DNA templat untuk proses PCR dapat dilakukan denganmenggunakan metode lisis sel ataupun dengan cara melakukan isolasi DNAkromosom atau DNA plasmid dengan menggunakan metode standar yang metode yang digunakan di dalam penyiapan DNA templat tergantungdari tujuan DNA templat dengan menggunakan metode lisis dapat digunakansecara umum , dan metode ini merupakan cara yang cepat dan sederhana untukpendedahan DNA kromosom ataupun DNA plasmid.

7 PRINSIP metode lisisadalah perusakan dinding sel tanpa harus merusak DNA yang karena itu perusakan dinding sel umumnya dilakukan dengan caramemecahkan dinding sel menggunakan buffer lisis. Komposisi buffer lisisyang digunakan tergantung dari jenis sampel. Beberapa contoh buffer lisisyang biasa digunakan mempunyai komposisi sebagai berikut: 5 mM Tris-ClpH8,5; 0,1 mM EDTA pH 8,5; 0,5 % Tween-20 dan 100 ug/mL Proteinase-K(ditambahkan dalam keadaan segar). Buffer lisis ini umumnya digunakan untukjenis sampel yang berasal dari biakan, sel-sel epitel dan sel akar lain dari buffer lisis adalah buffer lisis K yang mempunyai komposisisebagai berikut: buffer PCR (50mM KCl, 10-20mM Tris-Cl dan 2,5mM MgCl2);0,5 % Tween-20 dan 100 ug/mL Proteinase-K (ditambahkan dalam keadaansegar).

8 Buffer lisis K ini biasanya digunakan untuk melisis sampel yangberasal dari sel darah dan dengan cara lisis, penyiapan DNA templat dapat dilakukan dengancara mengisolasi DNA kromosom ataupun DNA plasmid menurut metodestandar yang tergantung dari jenis sampel asal DNA tersebut isolasi DNA kromosom atau DNA plasmid memerlukan tahapan yanglebih kompleks dibandingkan dengan penyiapan DNA dengan menggunakanmetode lisis. PRINSIP isolasi DNA kromosom atau DNA plasmid adalah pemecahandinding sel, yang diikuti dengan pemisahan DNA kromosom / DNA plasmid2222222222 Darmo Handoyo, Ari Rudiretnadari komponen-komponen lain. Dengan demikian akan diperoleh kualitas DNAyang lebih baik dan PrimerKeberhasilan suatu proses PCR sangat tergantung dari primer yangdigunakan.

9 Di dalam proses PCR, primer berfungsi sebagai pembatas fragmenDNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi(-OH) pada ujung 3 yang diperlukan untuk proses eksistensi primer dapat dilakukan berdasarkan urutan DNA yang telahdiketahui ataupun dari urutan protein yang dituju. Data urutan DNA atauprotein bisa didapatkan dari database GenBank. Apabila urutan DNA maupunurutan protein yang dituju belum diketahui maka perancangan primer dapatdidasarkan pada hasil analisis homologi dari urutan DNA atau protein yangtelah diketahui mempunyai hubungan kekerabatan yang melakukan perancangan primer harus dipenuhi kriteria-kriteriasebagai berikut:a. Panjang primerDi dalam merancang primer perlu diperhatikan panjang primer yang akandipilih.

10 Umumnya panjang primer berkisar antara 18 30 basa. Primer denganpanjang kurang dari 18 basa akan menjadikan spesifisitas primer ukuran primer yang pendek kemungkinan terjadinya mispriming (penempelanprimer di tempat lain yang tidak diinginkan) tinggi, ini akan menyebabkanberkurangnya spesifisitas dari primer tersebut yang nantinya akan berpengaruhpada efektifitas dan efisiensi proses PCR. Sedangkan untuk panjang primerlebih dari 30 basa tidak akan meningkatkan spesifisitas primer secara bermaknadan ini akan menyebabkan lebih umum dan PELAKSANAAN POLYMERASE CHAIN Reaction (PCR)b. Komposisi merancang suatu primer perlu diperhatikan komposisinya. Rentetannukleotida yang sama perlu dihindari, hal ini dapat menurunkan spesifisitasprimer yang dapat memungkinkan terjadinya mispriming di tempat lain.