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Quoi faire avec des résultats de qPCR - genomique.iric.ca

Genomic Platform Institute of research in immunology and cancer, University of Montreal 1 quoi faire avec des r sultats de qpcr Qu est-ce que le qpcr mesure? Si vous mesurez l expression d un g ne, le qpcr vous dira combien il y a d un ARNm sp cifique dans vos chantillons. Vous amplifiez une r gion de l ARNm avec des oligos et une sonde fluorescente. La machine qpcr mesure l intensit de fluorescence mise chaque cycle PCR. Pendant les premiers cycles, il n y a pas assez de fluorescence pour tre d tect e, mais rapidement la r action produit de plus en plus d amplicons et la courbe d marre.

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1 Genomic Platform Institute of research in immunology and cancer, University of Montreal 1 quoi faire avec des r sultats de qpcr Qu est-ce que le qpcr mesure? Si vous mesurez l expression d un g ne, le qpcr vous dira combien il y a d un ARNm sp cifique dans vos chantillons. Vous amplifiez une r gion de l ARNm avec des oligos et une sonde fluorescente. La machine qpcr mesure l intensit de fluorescence mise chaque cycle PCR. Pendant les premiers cycles, il n y a pas assez de fluorescence pour tre d tect e, mais rapidement la r action produit de plus en plus d amplicons et la courbe d marre.

2 Une courbe PCR a typiquement une phase exponentielle suivie d une phase plateau. La mesure de Ct doit tre prise dans la phase exponentielle, l o la pente est lin aire. On place le seuil (ligne rouge) dans cette phase, et le Ct se mesure l o la courbe PCR croise le seuil. La plupart du temps, une exp rience de qpcr exprime une expression relative , c est- -dire une variation de l expression d un g ne entre deux chantillons. D finitions des termes retrouv s dans le fichier excel de r sultats Contr le endog ne Le contr le endog ne est le g ne qui ne varie pas entre les chantillons test s. Par exemple : GAPDH, ACTB, TBP, HPRT, PPIA, YWHAZ Calibrateur Le calibrateur est l chantillon auquel tous les autres sont compar s.

3 C est l chantillon non trait ou temps z ro . Le RQ du calibrateur donne 1 car il ne varie pas par rapport lui-m me. Ct = Cycle Threshold Valeur laquelle la courbe PCR croise le seuil. Un qpcr comporte environ 40 cycles. Plus le Ct est lev (30-35), moins l ARNm d tect est pr sent, car il faut plus de cycles PCR pour Ct=22 Ct=24 Genomic Platform Institute of research in immunology and cancer, University of Montreal 2 pouvoir d tecter l amplification fluorescente. Si le Ct a une petite valeur (10-15), le g ne est fortement exprim . Les contr les endog nes ont souvent un Ct plus petit que les autres g nes.

4 Delta Ct = Ct g ne Ct contr le endog ne Delta Delta Ct = Ct chantillon1 Ct calibrateur Delta Ct SD = Standard Deviation cart type calcul par le logiciel. Cette erreur refl te la qualit des triplicatas technique pour le g ne test et pour le g ne endog ne pour un m me chantillon. Pour que la valeur soit consid r e comme valide, la SD doit se situer sous Si la SD est au-dessus de , la valeur du RQ est alors consid r e comme moins fiable. RQ = Relative quantification = 2- Ct Il s agit de votre Fold change. Le calibrateur est fix une valeur de 1. Les autres chantillons ont une valeur par rapport ce calibrateur.

5 Une valeur de 10 signifie que l expression de ce g ne est de 10X plus que le calibrateur. Une valeur de 0,1 signifie que l expression est de 10X moins que le calibrateur. Nous consid rons un r sultat comme significatif lorsque le fold-change est de minimum deux, c est- -dire un RQ de plus de 2 ou moins de 0,5. Cet intervalle constitue la variation de la technique. C est possible d obtenir un RQ de une journ e et de le lendemain. Si vous voulez observez un petit fold-change ( fold), il vous faudra des chantillons parfaitement propres, probablement faire des quadruplicata, penser utiliser 2 essais pour le m me g ne, et utiliser des contr le positif avec des fold-change connus.

6 RQmin and RQmax = valeurs de RQ possible d finies par l cart-type des deltaCts. Intevalle de confiance place 95%. Si vous voulez obtenir une vraie erreur biologique sur la valeur du RQ, vous aurez besoin de triplicata biologique. Ensuite, vous pouvez faire une moyenne des RQ ou des deltaCts des triplicatas. Si vous utilisez le 7900HT, le logiciel DataAssist peut le faire pour vous ( ). Qualit g n rale des r sultats Lorsque vous analysez vos r sultats, regarder les courbes d amplification, elles doivent tre belles et parall les. Les r pliquats techniques doivent tre l int rieur de cycles. Les Cts doivent tre <35.

7 Si vous croyez qu une courbe est bizarre, enlevez-la de l analyse. Si les courbes sortent apr s 35, ne les utilisez pas, ou soyez tr s prudent et assurez-vous que les r pliquats sont beaux. Si vous n avez pas acc s aux courbes d amplification, utilisez le Ct SD ou le DeltaCt SD. Cette erreur vous dira si les r pliquats sont beaux ( l int rieur de cycles). Un DeltaCt SD< est bon. Cette erreur ne peut pas valider la valeur biologique de vos r sultats, elle valide la m thode de mesure. Afin d obtenir des r sultats valables statistiquement, il vous faut des r pliquats biologiques. Si tous vos g nes sortent tr s tard (sp cialement les contr les endog nes), et que l ensemble des r sultats sont bizarres : v rifiez votre ARN.

8 C est la cause la plus Genomic Platform Institute of research in immunology and cancer, University of Montreal 3 commune de mauvais r sultats. V rifiez que votre ARN n est pas d grad (sur gel ou sur bioanalyseur) et v rifiez qu il n est pas contamin (ratios 260/280 et 260/230). Analyse avec plusieurs contr les endog nes La plupart du temps, un seul contr le endog ne est utilis . Mais utiliser 2 ou 3 contr les endog nes est de plus en plus recommand , et am liorera la pr cision de vos r sultats. Simplement testez plusieurs contr les et s lectionnez les g nes qui varient le moins entre les chantillons (le logiciel Genorm peut tre utilis pour cette s lection).

9 Si vous utilisez le Lightcycler 480, l analyse avec de multiples contr les endog nes est possible directement avec le logiciel de base. Si vous utilisez le 7900HT, t l charger le logiciel DataAssist ( ), et importer une analyse Individual Cts . Ce logiciel peut aussi faire une analyse avec vos r pliquats biologiques et faire un T test entre les groupes. Article int ressant sur les m thodes suivre en qpcr lorsqu on veut publier les r sultats. The MIQE guidelines The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT.

10 Clin Chem. 2009 Apr;55(4):611-22. Epub 2009 Feb 26 Genomic Platform Institute of research in immunology and cancer, University of Montreal 4 Pour faire l analyse soi-m me (7900HT) Comment utiliser le logiciel SDS Procurez-vous le logiciel SDS disponible pour le t l chargement dans votre compte sur notre site web ( ). Lorsque nous analysons une plaque avec l appareil 7900HT, le logiciel SDS cr e un fichier .sds avec les donn es brutes. 1. Ouvrir d abord ce fichier et cliquer en haut sur la fl che verte (analyse de la plaque par le logiciel). 2. Dans l onglet Setup, v rifier si les noms d chantillons et les noms de g nes sont corrects.