Sequenziamento del DNA con metodica Sanger

1 Sequenziamento del DNA con metodica Sanger1a generazionesequenziamento del DNA secondo il metodo SangerIl Sequenziamento automatico secondo il metodo Sangerha dominato nella scienza e nell industria per almeno 20 anni e ha consentito il Sequenziamento del genoma umano e la scoperta di oltre malattie genetiche monogenicheIl metodo Sanger considerato la tecnologia di prima generazione , mentre i nuovi metodi sono denominati next-generation sequencing (NGS) Sanger DNA sequencing2a generazione next-generation sequencing (NGS) Il principale vantaggio la possibilit tecnica di produrre un volume enorme di dati a costiestremamente pi bassi ed in tempiestremamente pi rapidiIl potenziale dell NGS simile ai primi tempi della PCR con il limite principale dovuto all immaginazioneNGSP reparazione del DNA da sequenziareUna comune strategia tecnologie NGS che il template adeso o immobilizzato su una superficie solida o supportoL'immobilizzazione di molecole spazialmente separate permette di eseguite simultaneamente migliaia o milioni di reazioni di sequenziamentoCome si prepara il DNA?

2 Tecniche basate sull PCR (emPCR) (454, Life) amplification (Solexa)Tecniche non basate sull dei primer (Helicos) del template (Helicos) dell enzima (Pacific, LI-COR)emulsion PCR (emPCR)emulsion PCR (emPCR)Il 5500xl SOLiD legge di basi/corsaSolid-phase amplification can produce 100 200 million spatially separated template clusters (Illumina/Solexa)I gruppi bloccanti attaccati al 3 causano un ostacolo nell incorporazione di un altro nucleotide, ma l ostacolo pu essere rimossoL Illumina HiSeq2000 legge oltre di basi di DNA per corsaA doubling of sequencing output every 9 months has outpaced and overtaken performance improvements within the disk storage and high-performance computation fieldsS D Kahn Science 2011.

3 331:728-729 Whole Genome Seq Exome Seq RNA Seq MeDIP Seq miRNA Seq Epigenetics, DNA methylation, ChIP-Seq Copy Number Variation Gut Bacteria / Metagenome Skin Bacteria / Metagenome Infectious Diseases NGS Applications in Cancer Biomarkers Stem Cells Detection of Genome Structural Variation Personalised Medicine ApplicationsThe term NGS defines very differentsizes of analysis! Whole genome@40 x (~140Gb of sequences/sample) Whole exome@60 x (~ 5Gb/sample) A set of 100 aver. candidate genes(exons) @100 x (~ Gb/sample) A single medium-size gene(exons and introns) @100x (~ ) The genome of James x coverage234 billions bp11 genetic diseases !!Whole Genome Seqvery heterogeneous genotype, genetic testing for 15/39 lociPedigree of the family and segregation of SH3TC2 mutationsArricchimento enrichment Tutti i geni (esoni+introni) di una regione cromosomica dove mappata una malattia genetica da causa ignota Tutti gli esoni di tutti i geni coinvolti in varie forme di quella malattia genetica Tutti gli esoni di tutti i geni noti del genoma umano (esoma umano)

4 Meno dell 1% delle mutazioni che causano malattie genetiche cadono fuori dagli esoniThe RNA is transcribed from PCR-amplified oligodeoxynucleotides originally synthesized on a microarray, generating sufficient bait for multiple captures at concentrations high enough to drive the hybridizationminigenome preparationCome si fa a comprendere quale variazione nella sequenza del DNA possa avere un significato patologico?