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T cnicas de Biolog a Molecular I. Enzimas de restricci n An lisis DNA Las enzimas de restricci n fueron aisladas de bacterias; su funci n natural es proteger contra DNA extra o II. Separaci n electrofor tica de mol culas de DNA (A) Geles de secuenciaci n (separaci n de bandas con 1 nt de diferencia) (B) electroforesis para RFLP (sepraci n entre 100 a 10000 nt) (C) electroforesis de campo pulsante (separaci n de DNA cromosomal) + + + III. Secuenciaci n de DNA por el m todo de Sanger No acepta elongaci n de la cadena de nucleotidos por la DNA polimerasa dsDNA molde ( secuencia?) 4 desoxiribonucle tidos (dNTPs) cebador de DNA DNA polimerasa 5 5 3 3 Secuenciaci n automatizada de DNA Marcaje de un fragmento de DNA (obtenci n de una sonda) dCTP[ P32] Hibridaci n y reconocimiento de secuencias con alta homolog a 65oC 50oC IV.

II. Separación electroforética de moléculas de DNA (A) Geles de secuenciación (separación de bandas con 1 nt de diferencia) (B) Electroforesis para RFLP (sepración entre 100 a 10000 nt) (C) Electroforesis de campo pulsante (separación de …

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1 T cnicas de Biolog a Molecular I. Enzimas de restricci n An lisis DNA Las enzimas de restricci n fueron aisladas de bacterias; su funci n natural es proteger contra DNA extra o II. Separaci n electrofor tica de mol culas de DNA (A) Geles de secuenciaci n (separaci n de bandas con 1 nt de diferencia) (B) electroforesis para RFLP (sepraci n entre 100 a 10000 nt) (C) electroforesis de campo pulsante (separaci n de DNA cromosomal) + + + III. Secuenciaci n de DNA por el m todo de Sanger No acepta elongaci n de la cadena de nucleotidos por la DNA polimerasa dsDNA molde ( secuencia?) 4 desoxiribonucle tidos (dNTPs) cebador de DNA DNA polimerasa 5 5 3 3 Secuenciaci n automatizada de DNA Marcaje de un fragmento de DNA (obtenci n de una sonda) dCTP[ P32] Hibridaci n y reconocimiento de secuencias con alta homolog a 65oC 50oC IV.

2 Southern Blot (detecci n de secuencias espec ficas de DNA) 1. Aislamiento de DNA 2. Cortar con enzimas de restricci n 3. Separar fragmentos por electroforesis 4. Desnaturalizar el DNA 5. Transferir a membrana de nitrocelulosa o nylon 6. Hibridar con sonda espec fica 7. Revelar con placa de Rayos X pantalla de fosforimager V. Northern blot (detecci n de secuencias espec ficas de RNA) A nivel de transcriptoma (RNA) Northern Blot 1. Aislamiento de RNA 2. Desnaturalizar el RNA 3. Separar por electroforesis desnaturalizante 4. Transferir a membrana de nitrocelulosa o nylon 5. Hibridar con sonda espec fica 6. Revelar con placa de Rayos X pantalla de fosforimager Expresi n de genes Bromuro de etidio Sonda P32 28S 18S Southern Blot Northern Blot VI. Western Blot (detecci n de prote nas espec ficas con anticuerpos) La detecci n de prote nas sirve para conocer: 1.

3 Niveles de expresi n 2. Isoformas 3. Modificaciones postraduccionales 4. Tiempo de vida media y degradaci n 5. Localizaci n subcelular VII. Reacci n en cadena de la polimerasa (PCR) Desnaturalizar Alineamiento Polimerizaci n cebador directo cebador reverso 94-95 C 55-65 C 72 C La amplificaci n es exponencial En 40 ciclos se obtienen millones de copias del gen o fragmento particular de inter s 1 2 4 8 Pruebas de identidad (PCR a nivel de DNA) El RT-PCR se puede utilizar como alternativa del Northern blot DNA: PCR Amplificaci n directa RNA: RT-PCR 1. Transcripci n reversa (obtenci n de cDNA) 2. Amplificaci n por PCR Exones + intrones Solo exones Despu s del PCR o RT-PCR los fragmentos se pueden clonar Los cebadores son dise ados con extremos reconocidos por enzimas de restricci n VIII. DNA recombinante DNA A DNA B DNA AB ligasa Mutag nesis sitio dirigida La mutaci n se incluye en uno de los cebadores para el PCR Mutag nesis dirigida Se pueden generar prote nas mutadas manipulando su DNA Generalmente la mutagenesis se hace por PCR: - Introduccion de mutacion puntual (cambio de un aminoacido por otro) - Deleciones Vectores de clonaci n 1.

4 Pl smidos 2. Fagos 3. C smidos 4. Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de ma z) 1. Pl smidos Se pueden clonar fragmentos entre 1,000 y 10,000 nucle tidos DNA doble cadena, circular, origen propio de replicaci n Marcadores de resistencia a antibi ticos Permiten la selecci n de bacterias transformadas con el pl smido o con el DNA recombinante Otras caracter sticas de los pl smidos Sitios de clonaci n m ltiples: varias enzimas de restricci n que solo cortan una vez en el pl smido Pl smidos de expresi n Caracteristicas adicionales: - Promotor regulable - Terminador de la transcripcion - Sitio de reconocimiento por el ribosoma M ltiples copias de DNA recombinante Obtenci n de m ltiples copias de la mol cula recombinante La transformaci n implica la introducci n de DNA extra o a una c lula hospedante Pl smido de bajo n mero de copias Pl smido de alto n mero de copias


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