Techniques d'extraction et de caractérisation d'une protéine

1 Techniques d'extraction et de caract risation d'une prot ine Doc 1: Doc 2: Centrifugation diff rentielle Doc 3: Doc 4: Solubilit de la -galactosidase en fonction du pH diff rentes concentrations de sels (NaCl). Doc 5: S paration de macromol cules par chromatographie d'affinit . Les carr s chancr s, les demi-cercles, et les triangles repr sentent sch matiquement les sites de liaison du ligand sur les macromol cules. Seuls les sites de liaison du ligand repr sent s par des cercles oranges avec des chancrures triangulaires se lient sp cifiquement aux ligands ancr s la matrice chromatographique. Toutes les autres macromol cules ne sont pas retenues et sont lu es lors du lavage. Doc 6: Chromatographie par gel-filtration Repr sentation sch matique de la chromatographie par exclusion de taille (gel-filtration).

2 (a) Une bille de gel est constitu e d'un gel-matrice et de canaux internes qui renferment un volume interne de solvant. Les petites mol cules peuvent entrer librement dans les espaces internes remplis de solvant. Par contre, les plus grosses mol cules ne peuvent pas entrer dans les porcs des billes du gel. (b) La solution chantillon commence entrer dans la colonne de gel. Les plus petites mol cules (en rouge) peuvent p n trer dans les pores du gel, et sont plus ralenties que les mol cules plus grosses (en bleu) qui ne peuvent pas entrer dans les pores du gel. (d) Les plus grosses mol cules sortent les premi res de la colonne, tandis que les plus petites sortent les derni res. La chromatographie d'exclusion mol culaire, galement appel e gel- filtration. Celte m thode s pare des prot ines selon leur taille.

3 La colonne contient un polym re avec des pores de taille s lective. Les plus grandes prot ines migrent plus vite que les plus petites parce qu'elles sont trop grandes pour entrer dans les pores des billes et prennent donc une route plus directe travers la colonne. Les plus petites prot ines entrent dans les pores et sont ralenties par les voies labyrinthiques qu'elles doivent prendre travers la colonne. Doc 7: D termination de la masse mol culaire d'une prot ine par chromatographie par gel-filtration Chromatographie par gel-filtration : m thode de s paration fond e sur la taille des mol cules. D roulement d'une chromatographie par tamisage mol Filtration sur gel a : deux prot ines, A et B (MA > MB), sont s par es, b : relation lin aire entre le volume d' lution V, et le logarithme d cimal de la masse mol culaire.

4 M ( : lactoglobuline, 37 kDa; : ovalbumine, 48 kDa: :phosphatase alcaline, 80 kDa; : lactate d shydrog nase. 135 kDa). Doc 8: D termination de la masse mol culaire d'une prot ine par Electrophor se SDS-Page La combinaison du sodium dod cylsulfate avec une prot ine. En ros : t te n gativement charg e du SDS. lectrophor se sur gel de polyacrylamide en pr sence de SDS des prot ines de la membrane rythrocytaire humaine (d'apr s Alloisio N. et Hum. Gen t. : 59. 68-71, 1981). a : nomenclature num rique des prot ines les plus abondantes, color es par le bleu de Coomassie : 1 : - spectrine. 2 : -spectrine; : ankyrine: 3 : transporteur des anions. et : bandes innomin es; 5 : actine (monom re); 6 : glyc rald hyde 3- phosphate d shydrog nase. b : repr sentation graphique de la distance de migration en fonction du logarithme de la masse mol culaire (exprim e en Da).

5 Doc 9: La chromatographie d'affinit . Doc 10: Chromatographie par change d'ions Supports changeurs d'ions utilis s pour la s paration des prot ines. Les supports se d composent en billes microscopiques, a: carboxym thylcellulose. b: di tnylamino thvlceUulose. Repr sentation sch matique illustrant la s paration de plusieurs prot ines par chromatographie d' changes d'ions par lution fractionn e. La partie brun clair de la colonne repr sente l' changeur d'ions et les bandes color es repr sentent les diff rentes prot ines a) Le m lange de prot ines est li . la partie sup rieure de l' changeur d'ions dans la colonne. b) Au cours de l' lution, les diff rentes prot ines se s parent sous forme de bandes discr tes en raison de leurs mobilit s diff rentes sur l' changeur d'ions compte tenu des caract ristiques pr dominantes de la solution.

6 A ce stade, la premi re bande de prot ine a travers la colonne et est recueillie s par ment, alors que les bandes restantes, moins mobiles, sont encore dans le haut le haut de la colonne (c) La concentration saline du tampon d' lution a augment afin d' luer les bandes restantes (d) Diagramme, d' lution du du m lange de prot ines la sortie de la colonne. Doc 11: Electrophor se Sur papier: Dans l' lectrophor se sur papier, l' chantillon est d pos en un point au milieu d'une bande de papier filtre ou d'ac tate de cellulose imbib e de solution tampon. Les extr mit s de la bande plongent dans deux r servoirs de tampon s par s dans lesquels sont plac es les lectrodes. Quand on fait passer un courant continu, les ions de l' chantillon migrent vers les lectrodes de signes oppos s, des vitesses diff rentes pour former, ventuellement, des bandes discr tes.

7 La vitesse de migration d'un ion est influenc e, dans une certaine mesure, par ses interactions avec la matrice support, mais elle est essentiellement fonction de sa charge. Lorsque l' lectrphor gramme est achev (en g n ral apr s quelques), la bande est s ch e et les constituants de l' chantillon sont localis s gr ce aux m mes Techniques que celles utilis es dans la chromatographie sur papier. lectrophor se sur papier, (a) Repr sentation sch matique de l'appareil utilis . L' chantillon est d pos . en un point au milieu de la feuille de papier imbib e de tampon. Les extr mit s du papier plongent dans les r servoirs de tampon dans lesquels sont plac es les lectrodes et n champ lectrique est appliqu , (h) Repr sentation sch matique d'un lectrophor gramme sur papier.

8 Notez que les ions positifs (canons) ont migr vers la cathode et que les ions n gatifs (anions) ont migr vers l'anode, les mol cules non charg es n' ont pas migr . Immnunopr cipitation: a: Electrophor se du m lange de prot ines, d pos dans le puits central. b: Diffusion: les prot ines (antig nes) et les anticorps vont la rencontre les uns des autres. La rencontre d'antig nes (a, b) et d'anticorps sp cifiques (anti-a. anti-b) produit des arcs de pr cipitation. BILAN. Les macromol cules cellulaires sont solubilis es en d sorganisant les cellules par diff rents traitements chimiques ou m caniques tels que les broyeurs. Apr s lyse des cellules, une purification partielle par centrifugation diff rentielles permet d' liminer les d bris cellulaires ou d'isoler un composant cellulaire int ressant.

9 Une fois sorties du contexte protecteur de la cellule, les prot ines et les autres mol cules de la cellule doivent tre trait es pour ne pas tre endommag es sous l'influence de pH ou de temp ratures extr mes, ou par d gradation enzymatique ou chimique, ou par manipulation grossi re. L' tat de puret d'une substance en cours de purification doit tre contr le tout au long de la purification par un dosage sp cifique. Les prot ines sont facilement purifi es en quantit appr ciable par pr cipitation fractionn e, o les solubilit des prot ines sont modifi es en faisant varier la concentration en sels ou le pH. La chromatographie par change d'ions utilise des supports tels que la cellulose ou des gels de polyacrylamide r ticul s. Les s parations sont dues aux interactions lectrostatiques diff rentes entre les groupes charg s du support changeur d'ions et ceux des substances en coins de s paration.

10 Dans la chromatographie sur papier, les compos s sont s par s par partage entre une phase mobile d'un solvant non-polaire et une phase stationnaire aqueuse qui impr gne les tissus du papier. On peut rep rer les mol cules en utilisant des colorants sp cifiques comme la ninhydrine pour les acides amin s et les peptides, ou des marqueurs radioactifs. Par chromatographie en gel-filtration, les mol cules se s parent en fonction de leur taille et de Ieur forme en utilisant des billes polyacrylamide ou d'agarose dont les pores ont des dimensions mol culaires. Une colonne de gel-filtration calibr e peut tre utilis e pour d terminer les masses mol culaires des macromol cules. La chromatographie d'affinit permet la s paration de biomol cules en utilisant leurs capacit s biochimiques uniques de se lier sp cifiquement d'autres mol cules.