Techniques de biologie moléculaire, génie génétique et ...

1 LEGTA de Quetigny (21) Classe pr paratoire ATS Bio (post-BTSA-BTS-DUT) biologie : Chapitre 9 : Techniques de biologie mol culaire, g nie g n tique et biotechnologies Cours complet r dig Page 1 EPLEFPA Dijon Quetigny Plombi res-l s-Dijon Site de Quetigny (21) LEGTA Olivier de Serres Classe pr paratoire ATS (Adaptation Technicien Sup rieur) biologie Pr paration des Concours agronomiques et v t rinaires (voie C) ENSEIGNEMENT DE biologie COURS Partie A. L unit et la diversit du monde vivant Sous-partie L unit et la diversit du monde vivant l chelle des organismes [ La modification du g nome des organismes au moyen des biotechnologies] Chapitre 9 Techniques de biologie mol culaire, g nie g n tique et biotechnologies Objectifs : extraits du programme La modification du g nome des organismes au moyen des biotechnologies - Les Organismes G n tiquement Modifi s (OGM) sont pr sent s.

2 Cette tude permet de montrer les m thodes de transfert des g nes d int r t par g nie g n tique : transferts directs ( lectroporation, micro-injection, biolistique) et indirects (transformation via un vecteur plasmidique, transg n se via un vecteur viral). - Les modalit s d int gration des g nes d int r t dans le g nome bact rien sont d crites. - Les principes d utilisation des mol cules des g nomes viraux (ADN de phage , ARN de r trovirus) en transg n se sont d crits. C est l occasion de d velopper l organisation et le fonctionnement viral Mots-cl s [Avantage s lectif, g ne d int r t, enzyme de restriction, vecteurs, virus, recombinaison g n tique, s lection des souches transform es, expression des transg nes] Ne pas tudier le d tail des Techniques impliquant les vecteurs et se limiter au principe g n ral.

3 Limiter la pr sentation des Techniques de biologie mol culaire (PCR et Blots) aux principes g n raux. Introduction Les Techniques de biologie mol culaire regroupent, au sens le plus large, l ensemble des Techniques permettant l tude et la manipulation des mol cules biologiques. Dans les faits, on entend surtout derri re ce terme les Techniques modernes d tude des macromol cules biologiques (prot ines, acides nucl iques), notamment les acides nucl iques. Dans une approche plus appliqu e aux besoins humains, on peut parler de biotechnologies pour d signer ce que l OCDE propose de d finir comme l application des principes scientifiques et de l'ing nierie la transformation de mat riaux par des agents biologiques pour produire des biens et services.

4 Les biotechnologies incluent notamment le g nie g n tique qui d signe l ensemble des Techniques permettant l utilisation ou la modification du g nome des organismes. Parmi ces Techniques , on peut citer la technique centrale que le programme invite tudier : la transg n se qui est la production d organismes g n tiquement modifi s (OGM) ou organismes transg niques, c est- -dire d organismes exprimant un g ne ext rieur (nomm g ne d int r t) leur esp ce ajout artificiellement par l homme leur g nome ( figure 1). Comment les progr s de la biologie mol culaire permettent-ils l tude des macromol cules aujourd hui ?

5 Comment le g nie g n tique permet-il la production d organismes g n tiquement modifi s (OGM) ? FIGURE 1. Un lapin transg nique (lapin GFP). La Green Fluorescent Protein (prot ine de florescence verte) est une prot ine initialement exprim e par des M duses et dont le g ne a t transf r de nombreux organismes par transg n se. (consultation d cembre 2015). LEGTA de Quetigny (21) Classe pr paratoire ATS Bio (post-BTSA-BTS-DUT) biologie : Chapitre 9 : Techniques de biologie mol culaire, g nie g n tique et biotechnologies Cours complet r dig Page 2 I.

6 Techniques de base d tude des macromol cules l heure de la g nomique et de la prot omique, la biologie mol culaire a b n fici ces derni res ann es du d veloppement et de la baisse du co t de nombreuses Techniques devenues d emploi quotidien dans les laboratoires. A. S paration, purification et isolement de macromol cules L une des premi res t ches possibles pour un biochimiste ou un biologiste mol culaire, c est la s paration des mol cules d un m lange de mani re les identifier et/ou obtenir une mol cule pure , lib r e du m lange dont elle est extraite.

7 1. S paration par migration dans un solvant (= luant) : les chromatographies a. Principe g n ral Une chromatographie est bas e sur la migration d une phase mobile (m lange dont on veut s parer les constituants), g n ralement sous l effet d un solvant qu on nomme luant, sur une phase fixe (support de migration), la diff rence d affinit entre les deux phases tant responsable de la migration diff rentielle des constituants de la phase mobile. Voir TP B3 (Structures de collecte de l nergie lumineuse) : chromatographie de pigments photosynth tiques Classiquement, l identification d une mol cule se fait par calcul d un rapport frontal (rapport de la distance de migration de la mol cule sur la distance de migration de l luant) (page ci-contre).

8 B. Aper u de la diversit des Techniques Un aper u des Techniques est propos par le tableau I. On peut citer les Techniques suivantes : Chromatographie sur papier WHATMAN : migration ascendante de l luant par capillarit dans un papier sp cifique (figure 2). Chromatographie sur couche mince : migration ascendante de l luant sur une couche siliceuse qui retient* plus ou moins les constituants (figure 2). Chromatographie sur colonne : migration descendante de l luant sur une couche de petites billes qui retiennent* plus ou moins les compos s.

9 On peut ainsi r cup rer les diff rents compos s des temps diff rents d lution. o Chromatographie sur colonne changeuse d ions (figure 3) : les billes retiennent* les compos s selon leur charge. o Chromatographie d affinit (figure 4) : sur les billes est fix un ligand qui retient* seulement les prot ines qui peuvent se fixer au ligand. o Chromatographie d exclusion (figure 5) : les billes laissent passer les compos s en fonction de leur taille. * La fixation d un compos la surface d un support fixe s appelle adsorption. TABLEAU I. Quelques Techniques de chromatographies : un comparatif.

10 D apr s DEN UD et al. (2010). LEGTA de Quetigny (21) Classe pr paratoire ATS Bio (post-BTSA-BTS-DUT) biologie : Chapitre 9 : Techniques de biologie mol culaire, g nie g n tique et biotechnologies Cours complet r dig Page 3 FIGURE 2. Chromatographie sur papier ou gel de silice. D apr s BREUIL (2007). FIGURE 3. Chromatographie sur colonne changeuse d ions. D apr s BREUIL (2007). FIGURE 4. Chromatographie d affinit . D apr s BREUIL (2007). FIGURE 5. Chromatographie d exclusion. D apr s BREUIL (2007). LEGTA de Quetigny (21) Classe pr paratoire ATS Bio (post-BTSA-BTS-DUT) biologie : Chapitre 9 : Techniques de biologie mol culaire, g nie g n tique et biotechnologies Cours complet r dig Page 4 2.