TECHNIQUES: Principes de la chromatographie

1 11 TECHNIQUES: Principes de la chromatographie2D finitionLa chromatographie est une m thode physique de s parationbas e sur les diff rentes affinit s d un ou plusieurs compos s l gard de deux phases (stationnaire et mobile).L' chantillon est entra n par la phase mobile au travers de la phase stationnaire qui a tendance retenir plus ou moins les compos s de l' chantillon l'aide de diff rentes interactions. L chantillon est adsorb puis d sorb sur la phase stationnaire, ou est plus ou moins solubledans la phase mobile. 23 Types de chromatographiesTypeCrit re de s parationAdsorptionPolarit PartageSolubilit ExclusionTaille des mol cules changeuse d ionsCharge ioniqueAffinit Structure des prot inesIl est rare de pouvoir associer une m thode chromatographique un seul ph nom de chromatographiesChromatographie changeuse d ionsChromatographie d exclusion35 Chromatographies d adsorptionPhase mobileNomGazChromatographie en phase vapeur (CPV) ou en phase gazeuse (GC)LiquideChromatographie couche mince (CCMou TLC)

2 Ou clairLiquideChromatographie liquide haute performance (CLHP ou HPLC)6 Utilit de la chromatographieSelon la quantit de produit appliqu en chromatographie , on s en sert pour: Analyser< 1 mg de produit par CCM, HPLC ou CPV S parer ou purifierles produits d une r action par chromatographie clair ou HPLC (50 mg 15 g) Doserdes produits. L analyse quantitative se fait avec un talon interne ou apr s pr paration d une courbe de calibration. 47 chromatographie d adsorption: principeLa chromatographie d adsorption est bas e sur le partage des solut s entre l adsorbant solide fixeet la phase mobile.

3 Chacun des solut s est soumis une force de r tention par adsorption et une force d entra nement par la phase mobile. L quilibre qui en r sulte aboutit une migration diff rentielle des solut s de l chantillon analyser, cequi permet leur s s paration sont bas es sur le principe de polarit , c est- -dire l existence de dip les dans une structure mol possibles (du moins polaire au plus polaire):Papier, cellulose, amidon, carbonate de sodium, gel de silice, alumine, charbon activ .8 AdsorbantsLes adsorbants sont sous forme de granules calibr s. La s paration est meilleure, mais plus lente si les grains sont fins.

4 Plus un adsorbant est actif, plus il retient fortement les compos s polaires. La s paration se fait par ordre croissant de leurs forces d interaction avec les compos s des groupements fonctionnels neutresLe gel de silice est polaire, il a par cons quence une plus grande affinit pour les compos s polaires:Un compos peu polaire est peu adsorb .Un compos polaire est tr s adsorb .R-HR-XR-NO2 RORRORORRORHORNR2 OROHOR-NH2 R-OH Ar-OHPolarit croissanteLes mol cules charg es ne migreront habituellement pas sur gel de silice, elles sont trop mobileUne phase mobile liquide est appel e luant.

5 C est elle qui fait migrer les compos s, son choix est donc important. Il faut que le solut soit solubledans l est possible de faire des m langes de solvants pour changer sa polarit .Polarit croissanteHexanesCCl4 Benz ne, Tolu neEt2 OCH2Cl2 AcOEtMeOH, EtOHAcOH611 Deux facteurs interviennent lors de l interaction entre l luantet le solut (m lange de compos s s parer): la solubilit : on doit tre en mesure de dissoudre le solut dans l luant pour que la migration se fasse. la polarit de l luant va d terminer quelle vitesse le compos un compos est polaire, moins il s accroche l adsorbant, plus il migre avec l d un luant peu polairePlus un compos est polaire, plus il s accroche l adsorbant, moins il migre avec l luant.

6 Choix d un luant polaireChoix de l luant12 chromatographie sur couche minceL adsorbant (silice, 250 m d paisseur) est fix sur une plaque (Al, verre) commercialement produit/m lange de produits est d pos sur la plaque l aide d un produits sont r v l s apr s paration d un capillaireAu laboratoire, les capillaires sont pr par s au d part de pipettes Pasteur: Chauffer la partie centrale de la pipette dans la flamme d une torche au propane en tournant le tube jusqu ce qu il soit mou. Retirer de la flamme et tirer la pipette. Laisser refroidir et couper la partie fine du des analytiques(250 m, x cm) V rifier la puret d un produit, quelques microgrammes suffisent Suivre l avancement d une r action V rifier l efficacit d une extraction liquide-liquide D terminer l luant pour la chromatographie clair sur gel de silice2.

7 CCM pr paratives(1000 m, 20 x 20 cm) Purification de petites quantit s de produit (jusqu ~100 mg sur une plaque de 20 x 20 cm). La bande qui contient le produit purifi est gratt e, puis la silice est extraite avec un solvant. 815Pr paration de la CCMABC1. On trace un trait ~1 cm du bord inf rieur de la marque les futur d p ts, espac s d environ identifie chaque produit qu on fera Le produit/m lange doit toujours tre dilu dans un solvant (Et2O, CH2Cl2, ) assez un vial, d poser 1 goutte ou 2-3 cristaux de produit + ~ mL lution de la CCM3. On utilise un capillaire pour d poser le produit sur la plaque puis on laisse vaporer le solvant.

8 On peut spotter 2-3 fois si l chantillon est tr s dilu .4. lution: pr parer une cuve d lutionavec B cher de 250 mL avec un papier absorbant l int rieur Verre de montreY verser 10 mL d luant (ex. 8 mL Hex + 2 mL AcOEt)Placer la CCM dans la cuve en veillant ce que la ligne soit au-dessus du luer jusqu ~5 mm du bord et tracer un trait pour marquer le front de v lation de la CCM l il nu: si le produit est color la lampe UV: les mol cules qui absorbent les UV 254 nm seront visibles (noyaux aromatiques par exemple). Avec un r v lateur chimique:l iode est le premier r v lateur tester, car il est non destructif.

9 Il permet de r v ler des doubles liaisons et les halog nures. L iode est vapor chaud ou dans la hotte. De nombreux autres existent: KMnO4, acide phosphomolybdique, vanilline, KMnO418 Mesure du RfProduit moins polaire, moins accroch Produit plus polaire, plus accroch 1et 0 entrevaleur solvantdefront du Hauteur migration deHauteur RfLe Rf(rapport frontal ou r tention frontale) est caract ristique d un produit dans un luant donn et pour une phase stationnaire donn e. Ll1l21019 Influence de l luantLorsque la polarit du solvant augmente, le Rfaugmente.

10 Le Rfaugmente, puis diminue. Pour faire une s paration de deux produits par chromatographie , on cherche un luant qui donne le plus grand Rfpossible, avec un Rfpour le produit le moins polaire autour de 0, de l luant100% Hexane95% Hex ane5% AcOEt90% Hexane10% AcOEt80% Hexane20 % Ac OE t70 % Hex ane30% AcOEt20 CCM bidirectionnellesC est une exp rience qui permet de prouver si un produit d compose sur la silice, ou si un spot de la CCM contient en fait deux produits. Si lu dans un autre solvant