UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI NAPOLI “FEDERICO II” …

1 UNIVERSIT DEGLI STUDI DI NAPOLI FEDERICO II Scuola di Dottorato in Medicina Molecolare Dottorato di Ricerca in Genetica e Medicina Molecolare Ruolo patogenetico del trasportatore per l L-glutammato (GltT) in un modello murino di meningite meningococcica Coordinatore: Candidato: Prof. Carmelo Bruno Bruni Dott. Florentia Lamberti Anno 2007 2 UNIVERSIT DEGLI STUDI DI NAPOLI FEDERICO II Dipartimento di Biologia e Patologia Cellulare e Molecolare Luigi Califano Dottorato di Ricerca in Genetica e Medicina Molecolare Coordinatore Prof.

2 Carmelo Bruno Bruni Sede amministrativa: Dipartimento di Biologia e Patologia Cellulare e Molecolare Luigi Califano 3 UNIVERSIT DEGLI STUDI DI NAPOLI FEDERICO II Dipartimento di Biologia e Patologia Cellulare e Molecolare Luigi Califano Tesi di Dottorato di Ricerca in Genetica e Medicina Molecolare XX ciclo Ruolo patogenetico del trasportatore per l L-glutammato (GltT) in un modello murino di meningite meningococcica Canidato: Florentia Lamberti Docente guida: Paola Salvatore 4 INDICE INTRODUZIONE ..8 Neisseria meningitidis: caratteri Neisseria meningitidis come paradigma di variazione Variazione genetica e regolazione genica: strategie per un rapido adattamento Rilevanza funzionale della variazione genetica: il ciclo infettivo di Neisseria Patogenesi e fisiopatologia della malattia Epidemiologia, prevenzione e controllo dell infezione da Modelli animali per lo studio della meningitie Geni metabolici implicati nella patogenicit di N.

3 Metabolismo del carbonio in N. Influenza del lattato sul metabolismo e sulla patogenicit di N. meningitidis e N. Metabolismo del glutammato in N. I trasportatori del GltT: un nuovo trasportatore per l L-glutammato in N. 63 SCOPO DELLA MATERIALI E Ceppi batterici e condizioni di Ceppi Preparazione della dose d Tecnica di infezione ..71 Saggio di Analisi microbiologica ed Saggio di confezione e valutazione dell indice di competizione ..74 Analisi Trasformazione dei 5 Estrazione e purificazione del DNA cromosomale da ceppi di N. Procedure di amplificazione mediante reazione a catena della polimerasi (PCR).

4 76 Analisi del DNA batterico tramite Southern Plasmidi e procedure di RISULTATI ..78 Modello murino di meningite Profilo di survival DEGLI animali infettati con il ceppo di N. meningitidis 93/4286wt ..80 Conte batteriche nell ospite animale dopo l infezione con il ceppo di N. meningitidis 93/4286wt ..81 Valutazione dei parametri clinici della meningite Caratterizzazione istolopatogica della meningite Inattivazione funzionale di geni potenzialmente implicati nel processo Profilo di survival DEGLI animali infettati con i ceppi isogenici 93/4286 gltT e 93/4286 Titoli batterici negli animali infettati con i ceppi isogenici 93/4286 gltT e 93/4286 Valutazione dei parametri clinici della meningite meningococcica DEGLI animali infettati con il ceppo 93/4286wt e con i ceppi isogenici 93/4286 gltT e 93/4286 gltS.

5 97 Analisi istopatologica DEGLI animali infettati con il ceppo 93/4286wt e con i ceppi isogenici 93/4286 gltT e 93/4286 gltS ..100 Saggio di coinfezione con il ceppo 93/4286wt ed il mutante isogenico 93/4286 gltT e valutazione dell indice di competizione ..102 RINGRAZIAMENTI ..113 6 PREMESSA Il genere Neisseriae comprende un ampia variet di specie non patogene, tra cui Neisseria lactamica, Neisseria flava, Neisseria subflava, Neisseria mucosa, Neisseria sicca, naturali commensali delle prime vie respiratorie. L importanza clinica di questo gruppo di cocchi piogeni per legata a due specie patogene, Neisseria gonorrhoeae (gonococco) e Neisseria meningitidis (meningococco), identificate rispettivamente nel 1879 da Albert Neisser e nel 1887 Anton Weichselbaum.

6 N. gonorrhoeae e N. meningitidis sono patogeni strettamente correlati con un solo habitat: l uomo; ad oggi non sono conosciuti ulteriori serbatoi o vettori di infezione. Se da un lato questo ristretto spettro d ospite costituisce un punto di forza del modello Neisseria, in quanto minimizza le possibili interazioni che il batterio pu stabilire durante l infezione e semplifica l individuazione delle forze evolutive che governano il comportamento microbico, dall altro tale fenomeno preclude l uso di un modello d infezione animale naturale. N. gonorrhoeae l agente eziologico della gonorrea, malattia sessualmente trasmessa e descritta fin dai tempi pi antichi (si ritrova, per esempio, nel papiro di Ebers che risale circa al 1550 ); rappresenta, ancora oggi, una delle pi frequenti malattie batteriche contagiose per l uomo, nonostante la disponibilit di farmaci antimicrobici sempre pi efficaci.

7 N. meningitidis causa frequentemente infezioni nasofaringee localizzate asintomatiche, similmente alle colonizzazioni mucosali delle specie non patogene di Neisseria, ma occasionalmente ed in condizioni non ancora ben determinate, il meningococco dissemina, causando severe malattie che mettono a rischio la vita come la meningite meningococcica, la batteremia, e l artrite settica. N. meningitidis pertanto considerato un batterio dal doppio stile di vita: commensale-patogeno. I fattori responsabili del passaggio dallo stato commensale a quello patogeno non sono per ancora ben chiari.

8 7 Negli ultimi anni sono stati condotti numerosi STUDI allo scopo di identificare i potenziali fattori di virulenza responsabili dell azione patogena del batterio, che risulter , di conseguenza, attenuata nei ceppi che presentano mutazioni dei geni responsabili dell espressione di tali determinanti di patogenicit . Tali geni, pertanto, non saranno presenti o saranno differenzialmente espressi nei ceppi apatogeni. Il potenziale patogeno di un ceppo batterico pu essere, infatti, dovuto alla presenza di sequenze patogeno-specifiche, ovvero pu essere il risultato dell espressione differenziale di determinati geni.

9 8 INTRODUZIONE Neisseria meningitidis: caratteri generali Le Neisserie sono tipici batteri Gram negativi, non sporigeni, provvisti di pili, le cui cellule assumono una forma coccoide e si ritrovano spesso in coppia, sotto forma di diplococchi appaiati a chicco di caff ; pi raramente formano tetradi o piccoli grappoli. I singoli cocchi sono di piccole dimensioni ed hanno un diametro di circa 0,6-1,0 m (Fig. 1). Figura 1. Fotografia al microscopio a scansione di Neisseria meningitidis Le Neisserie si moltiplicano in maniera ottimale in ambiente aerobio, umido e povero di ossigeno, che contiene il 5-10% di CO2, a temperature comprese tra i 35 ed i 37 C.

10 I gonococchi ed alcuni ceppi di meningococco crescono in anaerobiosi se coltivati in presenza di NO2 . Tutti i membri di questo genere, patogeni e commensali, producono il citocromo C, responsabile della positivit del test dell ossidasi. Le specie di Neisseria si distinguono in 9 base alla loro caratteristica capacit di utilizzare zuccheri semplici e composti come fonti di energia: normalmente i meningococchi fermentano sia il glucosio che il maltosio mentre i gonococchi fermentano solo il glucosio. Le Neisserie possono essere considerate batteri fastidiosi in quanto hanno esigenze nutrizionali abbastanza complesse.