Fundamentos y Tipos de ELISAs. - cultek.com

1 Fundamentos y Tipos de ELISAs. El ELISA se basa e el uso de ant genos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunol gica como enzim tica. Al estar uno de los componentes (ant geno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacci n ant geno-anticuerpo quedar inmovilizada y, por tanto, ser f cilmente revelada mediante la adici n de un substrato especifico que al actuar la enzima producir un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofot metro o un color metro.

2 Los diferentes Tipos de ELISA son los que se enumeran a continuaci n: Anticuerpos marcados: 8 ELISA Directo 8 ELISA Indirecto 8 ELISA s ndwich Doble (DAS) Heter logo (HADAS) Ant geno marcado 8 ELISA competitivo ELISA Directo. Consta de las siguientes etapas: Fijaci n al soporte insoluble ( tapizado ) de ant genos espec ficos. Lavado para eliminar los ant genos fijados deficientemente o no fijados. Adici n de anticuerpos marcados ( conjugados ) con una enzima; si los anticuerpos reaccionan con los ant genos, el complejo quedar solubilizado.

3 Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adici n de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacci n si se desea. Lectura visual o colorim trica del producto final coloreado. ELISA Indirecto. Consta de las siguientes etapas: Fijaci n al soporte insoluble de ant genos espec ficos para los anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los ant genos fijados deficientemente o no fijados. Adici n del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionar n espec ficamente con los ant genos fijados al soporte.

4 Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adici n de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos espec ficos a adidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los ant genos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adici n de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacci n si se desea. Lectura visual o colorim trica del producto final coloreado.

5 Soluciones ELISAP rotocolo y T gina 1 de 7 Pasos generales de un ELISA. 1. Tapizado del pocillo con el ant geno o anticuerpo. 2. Adici n de la muestra problema con la mezcla de ant genos o anticuerpos. 3. Uni n del ant geno o anticuerpo espec fico al anticuerpo o ant geno tapizado en el pocillo 4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de ant geno o anticuerpo no unido 5. Adici n del anticuerpo secundario marcado con la enzima 6.

6 Uni n del anticuerpo secundario al ant geno o anticuerpo 7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida 8. Adici n del substrato 9. Uni n del substrato a la enzima 10. Desarrollo del color ELISA S ndwich DAS (Double Antibody Sandwich). Consta de las siguientes etapas: Fijaci n al soporte insoluble de anticuerpos espec ficos del agente pat geno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.

7 Adici n de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma que si est presente el agente pat geno de diagn stico (ant geno), reaccionar espec ficamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los ant genos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados. Adici n de anticuerpos espec ficos del ant geno a detectar (deben tener un ep topo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los ant genos a adidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos.

8 Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adici n de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacci n si se desea. Lectura visual o colorim trica del producto final coloreado. ELISA S ndwich HADAS . Consta de las siguientes etapas: Fijaci n al soporte insoluble de anticuerpos espec ficos del agente pat geno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados. Adici n de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.)

9 , de tal forma que si est presente el agente pat geno de diagn stico (ant geno), reaccionar espec ficamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los ant genos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados. Adici n de anticuerpos espec ficos del ant geno a detectar (deben tener un ep topo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte), los cuales reaccionan con los ant genos a adidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos.

10 Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionado. Adici n de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adici n de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacci n si se desea. Lectura visual o colorim trica del producto final coloreado. ELISA Competitivo. Consta de las siguientes etapas: Fijaci n al soporte insoluble de anticuerpos espec ficos del agente pat geno a detectar.