LA DIAGNOSI DEI LINFOMI MALIGNI ATTRAVERSO …

1 LA DIAGNOSI DEILINFOMI MALIGNI ATTRAVERSO TECNICHE DI BIOLOGIA Cristina ColarossiAnatomia PatologicaIstituto Oncologico del MediterraneoCataniaLinfomi I LINFOMI sono malattie monoclonali neoplastichecaratterizzate dalla proliferazione di linfociti B o T negliorgani linfoidi. Causano un sovvertimento strutturale del linfonodo Nellamaggioranzadeicasiladiagnosisibasas uaspetti Nellamaggioranzadeicasiladiagnosisibasas uaspettimorfologici ed immunofenotipici Nel 5*15% dei casi sono necessarie analisi molecolari perconferma diagnosticaANATOMIA DEGLI ORGANI LINFOIDIC lassificazione dei linfomiA CELLULE B Immature Mature CLL/SLL A CELLULE T/NK Immature Mature NOS Angioimmunoblastico Folliculare Marginale Diffuso a grandi cellule Mantellare Burkitt Mieloma plasmacellulare Angioimmunoblastico Micosi fungoide/S zary Anaplastico a grandi

2 Cellule LINFOMA DI HODGKINC lonalit dei LINFOMI L analisi della clonalit delle cellule linfoidi attraversol amplificazione, mediante PCR, delle regioni VDJ dei genidelleimmunoglobuline (IG)e delrecettore dei linfociti T(TCR)permette di distinguere processi reattivi (policlonali)dalleneoplasie(monoclonali) dalleneoplasie(monoclonali) I segmenti genici V(Variable) sono collocatiall'estremit 5' di ciascun locus delle Ig. Sono lunghimediamente 300 bp. Isegmenti genici D(Diversity) sono collocati oltre isegmenti V e sono presenti solo nel locus per le catenepesantidelleIgLOCI DELLE IMMUNOGLOBULINE pesantidelleIg Isegmenti genici J(Joining) sono collocati a valle deisegmenti D.

3 Ciascun segmento J lungo 30*50 bp. Isegmenti genici C(Constant) codificano per laregione costante delle catene pesanti e delle cateneleggere IgLoci delle catene delle immunoglobulineTCR I loci codificanti per le quattro catene del TCR ( , , , )sono collocati sul cromosoma 7 sulcromosoma14 sulcromosoma14 Nei loci per i geni del TCR la struttura simile a quella deiloci genici per le Ig, si riscontrano ancora una voltasegmenti V, D, J e C. Le catene e non possiedono segmenti DLoci del TCRR iarrangiamenti genici I geni delle immunoglobuline e del TCR contengono moltisegmenti VDJ che vengono riarrangiati durante losviluppo iniziale dei linfociti Il processo di riarrangiamento affianca casualente unsegmentoV,unoD,edunoJinmododacreareler egionisegmentoV,unoD.

4 EdunoJinmododacreareleregionivariabili di geni ricombinati che possono essere trascrittiin mRNA e codificare per i recettori dell del Riarrangiamento I riarrangiamenti sono mediati da un complessoenzimatico nel quale le proteine RAG1 e RAG2agiscono tagliando a livello di speciali sequenzesegnale (regioni RSS) Dopo il taglio inserzioni o delezioni di nucleotidiaumentano la diversificazione L ultima tappa l avvicinamento dei segmentigeniciClonalit dei LINFOMI Clonalit LINFOMI B Valutazione molecolare delriarrangiamento del geneIgH:(catena pesante delleimmunoglobuline) Clonalit LINFOMI T Valutazione molecolare del riarrangiamento del gene gamma del recettore dei linfociti T (TCR gamma)immunoglobuline) Valutazione molecolare delriarrangiamento del geneIgK: (catena leggera delleimmunoglobuline)linfociti T (TCR gamma) Valutazione molecolare del riarrangiamento del gene beta del recettore delle cellule T (TCR beta).

5 BIOMED 2 Uno studio coordinato dal gruppoBIOMED 2(orachiamato euroclonality consortium) ha standardizzato iprotocolli con multipli set di primers (Van Dongen,Leukemia, 2003) Numerosilavoriscientificineldecenniosucc essivohanno Numerosilavoriscientificineldecenniosucc essivohannoconfermato la sensibilit , specificit e riproducibilit deitest Tali protocolli possono essere applicati allo studio dicampioni fissati in formalina ed inclusi in paraffina,agoaspirati e biopsie osteomidollari decalcificateLimiti degli studi molecolari Sensibilit limitatain caso di un normale backgroundpoliclonale, (es Linfoma B T cell rich)

6 Con percentuale dilinfociti clonali < 10% Clonale non sempre sinonimo di malignit (processilinfoproliferativi EBV correlati o proliferazioni cutaneebenigneafenotipoT)benigneafenotip oT) I riarrangiamenti di Ig e TCR non sono esclusivi diuna linea cellulare: riarrangiamenti di TCR possonoriscontrarsi in neoplasie immature a fenotipo B o alcuneleucemie mieloidi qualit del DNA Il DNA estratto da tessuti FFPE di qualit subottimale epotrebbe contenere inibitori della PCR E essenziale valutare l integrit e l amplificabilit del DNA Il protocollo BIOMED 2 ha standardizzato una multiplexPCRcontenenteiprimersdigenihous ekeepingdi100,PCRcontenenteiprimersdigen ihousekeepingdi100,200.

7 300 e 600 paia di basi Per l analisi di IGH/TCR la PCR di controllo dovrebbeamplificare prodotti di almeno 300 bpAnalisi qualitativa DNAAF4 PLZFRAG1 TBXASLa presenza delle 4 bande indica che il DNA genomico integro. La qualit del campione idonea pereffettuare amplificazioni, mediante PCR, anche diframmenti di grosse dimensioniClonalit IGH Tre set di primers amplificano 3 regioni nella regione variabile e la regione J Due set di primers amplificano la regione D e J L analisi dei prodotti di PCR pu essere condotta con metodica:metodica: Heteroduplex: i prodotti di PCR vengono denaturati a 95 , rinaturati a 4 e poi corsi su gel di poliacrilamideal 6% Gene scanning.

8 I primers devono essere marcati con fluorocromo per analizzare i prodotti di PCR con metodi automatizzati (es sequenziatore 3500)Clonalit IGHA nalisi dei prodotti di PCRA nalisi riarrangiamento del gene IGHI permutazione somatica (Maturazione dell affinit Negli organi linfoidi periferici i linfociti B maturi(centrociti o cellule del centro germinale)subiscono un ulteriore diversificazione nel sito diriconoscimento antigenico tramite il processo Dopo l incontro con l antigene e la stimolazione dellinfocita B da parte di un linfocita T helper, sigenerano dellemutazioni puntiforminelle regionigeniche codificanti per i domini variabili di Linfatica Cronica In circa il 50% dei casi la cellula neoplastica origina in unafase di maturazione linfocitaria antigene indipendente(pre*centro germinativo nel linfonodo).)

9 Non sonopresenti mutazioni somatiche del gene IgVH Nel restante 50% dei casi circa la cellula neoplasticaorigina in fase maturativa Ag dipendente, post presenti mutazioni somatiche delgene IgVHStato mutazionale di IGVH nella LLC M*CLL (mutata): a buona prognosi; U*CLL (non mutata) a prognosi infausta Cut*off: 98% di identit con la sequenza germline Cut*off: 98% di identit con la sequenza germline Linee guida per l analisi molecolare (EuropeanResearch Initiative on CLL, ERIC reccomendation) Lo stato mutazionale puo essere determinato in qualsiasi HypermutationTraslocazionie riarrangiamentineilinfomiRiarrangiamenti B*cell Linfoma/Leuk Catene pesanti IgT*cell Linfoma/Leuk T*cell receptorPatologiaTraslocazione Geni coinvoltiLinfoma follicolare t(14;18)BCL2*IgHLinfoma mantellare t(11.)

10 14)BCL1*IgHLinfoma di Burkitt t(8;14) MYC*IgHLinfoma anaplasticot(2;5)ALK*NPMBCL2/IGH t(14;18)(q32;q21) Presente nel 90% dei FL e nel 20% dei DLBCL Giustappone il gene che codifica per l elemento J dellecatene pesanti delle immunoglobuline, (14q32), al geneBcl*2 (18q21) PoneBCL2sottoildirettocontrollotrascrizi onaledi PoneBCL2sottoildirettocontrollotrascrizi onaledienhancers del locus IGH e successiva alterazionedell espressione della proteina La valutazione della traslocazione di ausilio diagnosticoper distinguere il linfoma da iperplasia linfoide benigna Monitorare la recidiva neoplastica e la malattia Maior Breakpoint Region (MBR).