Les Bonnes Pratiques en HPLC t UPLCHPLC et UPLC

1 Les Bonnes Pratiques en HPLC t UPLCHPLC et UPLCLes cl s de la r ussite pour vos analyses en HPLC et/ou UPLC 2015 Waters Corporation1V rifier votre configuration audio. Vous devez entendre une petite Bonnes Pratiques en HPLC t UPLCHPLC et UPLCLes cl s de la r ussite pour vos analyses en HPLC et/ou UPLCP hilippe VassaultResponsable Business Colonne Europe du SudL ChiLaura CharrierIng nieur Support Technique - France 2015 Waters Corporation2 Posez vos questions tout moment en utilisant la boite de dans les laboratoiresg S assurer et veiller l exactitude des r sultats analytiques via une d marche d assurance qualit une d marche d assurance qualit Minimiser le temps consomm dans le diagnostique de pannes instruments. Travailler avec des analyses robustes qui donneront des Travailler avec des analyses robustes qui donneront des r sultats p rennes quelques soit le technicien, le syst me, et le laboratoire.

2 2015 Waters Corporation3 Resultat du sondage d inscriptiongp Question 1 : Dans votre laboratoire, vous utilisez principalement Question 2 : Sur les 6 derniers mois, avez-vous rencontr des difficult s sur une de vos m thodes ? Question 3 : Quelle dur e de vie de colonne,en nombre QQ,d injections, attendez-vous ?De 100 15 000 2015 Waters Corporation4 SommaireSommaire Introduction Les aspects importants consid rer pour le bon d roulement Les aspects importants consid rer pour le bon d roulement d une analyse chromatographique : Les chantillonsLes phases mobiles Les phases mobiles Le syst me La colonne La m thode 2015 Waters Corporation5Pr paration de l chantillonp V rifier l absence de particules visibles apr s la dilution de l chantillonPhoto de cequepeutdonnerla dilution d un produitfini cause Photo de cequepeutdonnerla dilution d un produitfini cause d une formulation ou d une matrice complexe et d une description insuffisante ou inadequate de la monographieDonepezil Tablet Formulation.

3 Dilution en solvant agitation 2015 Waters Corporation6 Dilution en solvant, agitation m canique et sonication (d apr s la pharmacop e US)Les conseils pour la pr parationd chantillons HPLC/UPLC Une filtration syst matique : Sur filtre m compatible avec le diluent utilis .L tili tid filt litd L utilisationd un filtre en ligne estrecommand e. Une centrifugation peut tre n cessaire pour enlever les microparticules. Ut ifti d 4000 12000 RPM d t 5 30 i tt Une centrifugation de 4000 12000 RPM pendant 5 30 min permettrad enlever les particules invisibles. DonepezilTa b l e t dilu Echantillonapr s filtration Echantillonapr s filtration 2015 Waters Corporation7 DonepezilTa b l e t dilu pr par selon la monographieSALE (tr s mauvaise)Echantillonapr s filtration sur mParticules tr s fines: Solution trouble (toujoursmauvaise)Echantillonapr s filtration et centrifugation 12000 RPM Solution limpide(OK)Cas des chantillons biologiquesPourquoi des Echantillonsplus Propres ?

4 QppEliminer les interf rences de la matrice d chantillons Minimiserles effets de matriceoElimination de la suppression/accroissement ioniqueoR duction du bruit de fondMeilleureslimitesde d tectionsensibilit accrueMeilleureslimitesde d tection sensibilit accrue Moins de variabilit dans les r sultats obtenus Plus robustes entre les diff rentes matrices d chantillons Plasmas provenant de diff rents sujets ou esp cesG ibilit Gagner en sensibilit Minimiser l encrassement du syst me et le la colonne 2015 Waters Corporation8 Solutions de pr paration d chantillonpp Sirocco: Pr cipitation de prot ines rapide et simple Echantillon filtr s Ostro:Niveau Enl ve les prot ines et les phospholipides Combinaison d une Pr cipitation/filtration (pour les port ines) et d une interaction sur sorbent (pour les phospholipides)de propre Des chantillons biologiques plus propres rapidement Oasis:et croissa Sorbent polym rique pour de la SPE Disponible en diff rents formats et diff rentes chimies Plus sp cifique pour des chantillons plus 2015 Waters Corporation9 Recommandations Phases mobiles Utiliser des solvants, tampons et additifs de haute qualit Solvants organiques : Qualit High GradeLC ou LC/MS, ne pas les filtrer JT Baker, Biosolve, Fisher Optima LC/MS Grade L eau :L eau : L eau Milli-Q est filtr e travers une membrane m, pas besoin de la refiltrer.

5 Les tampons et r actifs compatibles LC/MS n ont pas besoin d tre re-pp/pfiltr s. Changer les phases aqueuses chaque jour (UPLC) ou tous les 2 jours (HPLC) 2015 Waters Corporation10 Ne pas transf rer les nouveaux solvants aqueux dans la bouteille d j en utilisation. Pr cautions prendre pour les phases mobiles Toutes les bouteilles doivent tre ferm es N tili d Pfil i l b t ill Ne pas utiliser du Parafilm pour couvrir les bouteilles oil peut se dissoudre et cr er un pic parasite. Utiliser des bouteilles avec une certaine qualit de verre en verre borosilicate pour les phases mobiles haut pH. Utiliser de la verrerie propre (pour les bouteilles et la filtration) Ne pas les laver au lave-vaisselle et utiliser des d tergents 2015 Waters Corporation11 Contamination bact rienne : source de probl me en UPLC comme en HPLC.

6 P La contamination bact rienne est une source classique de bouchage de colonne en UPLC, mais peut aussi l tre en HPLC Faire attention aux lignes100% aqueuses: Faire attention aux lignes100% aqueuses: Pr parer les phases 100% aqueuse : Les filtres en lignes peuvent laisser passer certaines bact : Meilleuresolution : oEn gradient: ajoutez 5 10% de solvant organique dans la bouteillecontenant la phase aqueuse et modifier le gradient en cons quence. oEn isocratique: pr m langezla phase mobile avec l organiquen isocratique: pr m langezla phase mobile avec l organiquen cessaire. Nettoyez r guli rement les cr pines 2015 Waters Corporation12 Autres sources de contamination Pr parez et manipulez les chantillons proprement : Utilisez des vials un niveau de certification adapt votred tectionet l application: 2015 Waters Corporation13votred tectionet l application: Vial selector Filter Selector et AstucesCERTIFIED Containers Qu est ce que c est ?

7 Un kit de bouteilles certifi s pour une faible Un kit de bouteilles certifi s pour une faible concentration TOC (Carbone Organique Total)o<15ppb TOC : les bouteilles ne contiennent pas de contaminants organiquesP it l bl d i ft oPour viter les probl mes de pics fant mes. Waters Certified Container Low Volume Kit R f rence 186007278R f rence 186007278 5 Bouteilles de 250 mL 1 Bouteille de 500 mL 1 kit de bouchons Trouver les sources d une contamination est consommateur de temps Utiliser des contenants Ultra-Clean est un 2015 Waters Corporation14 l ment cl permettant d obtenir des r sultats fiablesDysfonctionnements li s aux colonnes Colonne endommag e Hydrolyse du ligandyyyg Vide Bouchage Temps d quilibration/r quilibration insuffisant 10 volumes de colonnes pour une bonne quilibration Interactions secondaires Interactions ioniquesInteractions ioniques Interaction m talliques 2015 Waters Corporation15 Variabilit de fabricationWhat makes an LC column reproducible?

8 A) Sorbents B) Packing C) Engineering m ACQUITY UPLC BEH m XBridge BEH C18 m Core Shell C18(H, 4 sigma) Velocity, u (cm/sec)Plate Height (Acenaphthene, x 50 mm columns70/30 MeCN/H2O, 30 C, 254 nm 2015 Waters Corporation16 All are CRITICAL!Effet d un vide pr sent dans la colonneColonne bien remplieColonne avec un espace vide p Changement de forme de pic 2015 Waters Corporation17 Changement de forme de pic Changement de sensibilit Changement de r solutionTrucs est AstucesRecommandations Colonnes Une colonne d j utilis e peut avoir t alt r e chimiquement Lors de l utilisation d une nouvelle colonne, si la colonne a t alt r e, les r sultats seront diff viter d avoir refaire un d veloppementPour viter d avoir refaire un d veloppement Toujours utiliser une Colonne neuve lors d un d veloppement de m thode 2015 Waters Corporation18 Usage de pr colonnes pour augmenter la dur e de vie des colonnes Echantillon alimentaire contenant de la cellulose de la cellulose 2015 Waters Corporation19 Echantillon alimentaire contenant de la cellulose, de la cellulose v g tale, de la silice et du st arate de magn sium dissout dans 50/50 Eau/Ac tonitrileInconv nient des colonnes de garde.

9 G Source de fuites potentielles Perte de r solution cause de connexions inadapt es Perte de r solution cause de connexions inadapt es Source de variabilit inter laboratoire Augmentation du temps de r tention N cessit d avoir la m me chimie que la colonne pour limiter les risques de changement de s lectivit 2015 Waters Corporation20 NOUVELLES colonnes de gardeg Nouveau format de pr colonnes pour l HPLC : Connexion directe sur la colonne pour minimiser les volumes mortsConnexion directe sur la colonne pour minimiser les volumes mortsoChoix entre deux formats de ferrrule d entr e de colonne Haute performance du packing pour maintenir la s parationDisponible sur toutes les granulom tries (2 5 m 5 m) Disponible sur toutes les granulom tries ( m 5 m) 2015 Waters Corporation21 Nouvelles pr colonnes VanGuardp Augmentez la dur e de vie de vos colonnes sans perdre la qualit de vos s parations.

10 Qp 2015 Waters Corporation22 Trucs est AstucesRecommandations Colonnes Tester 3 lots diff rents de colonnes pour juger de la qualit , de la fiabilit de la robustesse de la m avec un kit de Method Validation ACQUITY UPLC CSH x 50 mm Method Validation Kit (P/N 186005571) 103 Lot 109 Acceptance Zip-Imp Zip-Imp Zip-Imp Zip-Imp 109 2015 Waters Corporation23 TestpCriteriaZiprasidonepp1pp2pp3pp4 ResultIntermediate Precision Ret Time < 2% Area < 5% me de perte de performance :pp Performance requise pour l analyse : R sultat obtenu sur une colonne neuve : 2015 Waters Corporation24 Noix de la ferrule sertie de mani re incorrecteincorrecteN 5sigma = 5025 Facteur de train ee = de train ee position de la noix de ferruleN 5sigma = 6959 Facteur de train e = 2015 Waters Corporation25 Position correcte de la noixde ferruleEffet m moire sur un chantillonDes connexions incorrectes sur la vanne d injection peuvent tre responsables de volume mort o peuvent s accumuler certains produits.