Lezione 5 (immunochimica) - Università degli Studi della ...

1 TECNICHE IMMUNOCHIMICHETECNICHE IMMUNOCHIMICHEANTIGENE:molecola che, introdotta in un organismo, in grado di attivare larisposta anticorpale. Gli antigeni sono tipicamente macromolecole solubili in acquae che possiedono un alto grado di complessit chimica. Maggiore il pesomolecolare, maggiori le probabilit che funzionino come antigeni. Le proteineeterologhe (cio , provenienti da organismi diversi dall animale trattato) di massaALCUNE ALCUNE >10000 Da sono generalmente degli ottimi antigeni, mentre i piccolipeptidi non sono di solito sono essenzialmente lepropriet di un antigene: IMMUNOGENICIT :capacit di indurre una risposta immunitaria ANTIGENICIT :capacit di reagire in maniera specifica con i prodotti finalidelle risposte immuni (anticorpi e/o recettori di membrana) Estraneit :il sistema immunitario in grado di discriminare il self dal non self , di conseguenza,le molecole estranee ad un determinato organismo hanno capacit immunogenica; Specie animale:le propriet immunogene di un antigene variano a seconda della specieanimale utilizzata per la produzione di anticorpi.

2 Peso molecolare:pi elevato il peso molecolare della molecola in esame e maggiore sar laDa che cosa dipende l immunogenicit di una sostanza?ALCUNE ALCUNE di avere una risposta immunogenica; Degradabilit :macromolecole insolubili sono pi immunogene di quelle pi piccole e solubili,poich vengono pi facilmente fagocitate ed elaborate dal sistema macrofagico; Complessit chimica e strutturale delle molecole:l eterogeneit chimica apportaimmunogenicit . Ad esempio omopolimeri anche adeguatamente grandi hannoimmunogenicit bassa se confrontata con polimeri, contenenti aminoacidi diversi, dello stessopeso molecolare. D altra parte, gli antigeni proteici risultano tanto pi immunogeni quanto pi sono complessi i loro livelli di organizzazione molecolare(struttura terziaria e quaternaria).No, infatti esistono piccole sostanze organiche, detteapteni, monovalenti (con ununico determinante antigenico), antigeniche, ma non immunogeniche.

3 Possonovenirelegateartificialmenteinmodo covalenteadunaproteinacheprendeilTutte le sostanze sono immunogeniche?ALCUNE ALCUNE dicarrier(BSA, KLH) e funzionare come epitopi naturali, scatenando la anticorpi, prodotti dalle plasmacellule, appartengono al gruppo di proteine notecomeimmunoglobuline (Ig), classificabili in cinque diverse classi:IgG, IgA, IgM, IgE, eIgD. Gli anticorpi strutturalmente pi semplici sono leIgG, costituite da quattro catenepolipeptidiche: due catene leggere identiche tra di loro e due catene pesantianch'esse identiche tra loro; rappresentano circa l 80% delle Ig del ALCUNE :Fragment antigen bindingFc:Fragment crystallizableFabPonti disolfuroCatene leggere25 kDa, 220 aaCatene pesanti50 kDa, 440 aaCatena leggeraCatena pesanteFcZona variabileZona costanteZona costanteZona variabileALCUNE ALCUNE ALCUNE antigene-anticorpo Sistema chiave-serratura : L unione che si instaura tra un antigene ed il corrispondente anticorpo porta allaformazione di quello che viene definitoIMMUNOCOMPLESSO.

4 Tale unione altamente specifica ed regolata da forze di tipo chimico-fisico (legami di naturanon covalente) che agiscono tra i determinanti dell antigene e dell anticorpo(Forze di Coulomb, Forze di Van der Waals, legami H); La formazione degli immunocomplessi determina una serie dieventi finalizzati alladefinitiva distruzione o neutralizzazione dell antigene. L equilibrio fra antigene e l anticorpo viene espresso dalla legge di massa: Quando, per una determinata concentrazione di Ag, si ha:AbAgAgAb +[][] []daK1 AgAbAbAgK= =[][]AbAgAb=ALCUNE ALCUNE i siti antigenici dell anticorpo sono saturatiper met con l antigene, allora ilvalore del reciproco della concentrazione dell antigene libero sar uguale allacostante di affinit :La costante Ka(anchecostante di associazione) definita dalla concentrazione diantigene libero necessario perch venga raggiunto il 50% disaturazione dei sitianticorpali eduna misuradell affinit intrinseca odella stabilit del legame Ag-Ab.

5 []daK1Ag1K== Il valore della costante di affinit di un anticorpo per un dato antigenedetermina,negli esperimenti immunochimici,sia il limite di rilevabilit (che migliora conl aumentare dell affinit ),sia la specificit (che cresce all aumentare delladifferenza tra il valore della costante di affinit di un Ab verso l Ag specifico e quelloALCUNE ALCUNE ad un Ag meno specifico); Le Kaffpossono variare da 109 1010M-1nel caso di anticorpi con elevata affinit perl antigene, a 104 105M-1nel caso, invece, di immunoglobuline con bassa affinit . Affinit :forza dell interazione antigene-anticorpo, misurata dalla costante di equilibrio dellareazione di associazione; Reazione antigene-anticorpo:reazione dinamica e reversibile tra un anticorpo e un antigeneper dare origine al complesso antigene-anticorpo. E caratterizzata da una costante diequilibrio definita; Immunogeno:sostanza antigenica (antigene, coniugato aptene-proteina) che, in contatto conALCUNE ALCUNE ospite immunocompetente, capace di stimolare la produzione di anticorpi specifici; Sito legante anticorpale (paratopo):regione della molecola anticorpale capace di combinarsicon il corrispondente determinante antigenico; Determinante antigenico (epitopo):elemento strutturale della molecola antigenica riconosciutodall anticorpo e capace di combinarsi con il corrispondente sito legante anticorpale.

6 Marcatore:sostanza (radioisotopo, enzima, fluoroforo ecc) che introdotta nella struttura di unreagente (antigene, aptene, anticorpo) ne consente la specificit delle reazioni antigene-anticorpo e la sensibilit di marcatori (enzimi, isotopi, sostanze fluorescenti, radicali liberi) possono esserecombinateinsiemepercompiereun dosaggioimmunologico ,ossiaTECNICHE IMMUNOCHIMICHE combinateinsiemepercompiereun dosaggioimmunologico ,ossiaquantificare con precisione una sostanza antigenica, presente, nel nostrocaso, nei fluidi marcatiIMMUNODOSAGGIM etodi non marcatitraccianti radioisotopici, enzimatici, AgglutinazioneSe avviene in soluzione acquosaPrecipitazioneSe avviene in matrice solidafluorimetrici, bioluminescenti,chemiluminescentiIndiret tase l antigene, solubile, si fa adsorbire o legare covalentemente a carrier insolubili (sfere di lattice, globuli rossi)Direttase l antigene corpuscolato ( cellule , batteri)Reazioni di agglutinazione/precipitazioneIn adatte condizioni sperimentali (pH, temperatura, forzaionica)

7 , e conadatti rapportistechiometrici, si pu ottenere la precipitazione del complesso antigene-anticorpo,anche di peso molecolare molto REAZIONI DIDIAGGLUTINAZIONE/PRECIPITAZIONEAGGLUTI NAZIONE/PRECIPITAZIONETest di precipitazione ad anello, Ring TestREAZIONI REAZIONI DIDIAGGLUTINAZIONE/PRECIPITAZIONEAGGLUTI NAZIONE/PRECIPITAZIONEREAZIONI REAZIONI DIDIAGGLUTINAZIONE/PRECIPITAZIONEAGGLUTI NAZIONE/PRECIPITAZIONER icerca di IgM o IgG per verificare la infezione in corso o verificare la infezione in corso o gi avvenuta!!!REAZIONI REAZIONI DIDIAGGLUTINAZIONE/PRECIPITAZIONEAGGLUTI NAZIONE/PRECIPITAZIONEREAZIONI REAZIONI DIDIAGGLUTINAZIONE/PRECIPITAZIONEAGGLUTI NAZIONE/PRECIPITAZIONEREAZIONI REAZIONI DIDIAGGLUTINAZIONE/PRECIPITAZIONEAGGLUTI NAZIONE/PRECIPITAZIONEREAZIONI REAZIONI DIDIAGGLUTINAZIONE/PRECIPITAZIONEAGGLUTI NAZIONE/PRECIPITAZIONESe l immunoprecipitazione avviene in un gel, si parla pi propriamente diImmunodiffusioneMetodi di immunodiffusione pi comuni per il dosaggio di antigeni.

8 REAZIONI REAZIONI DIDI PRECIPITAZIONEPRECIPITAZIONE Immunodiffusione radiale semplice Immunodiffusione doppia ImmunoelettroforesiImmunodiffusione radiale sempliceIl diametro dell anello sar funzione della concentrazione dell antigeneREAZIONI REAZIONI DIDI PRECIPITAZIONEPRECIPITAZIONEI mmunodiffusione radiale sempliceIl diametro dell anello sar funzione della concentrazione dell antigeneREAZIONI REAZIONI DIDI PRECIPITAZIONEPRECIPITAZIONEC ostruzione retta di taratura: Immunodiffusione doppia (metodo di Ouchterlony)REAZIONI REAZIONI DIDI PRECIPITAZIONEPRECIPITAZIONEa e b : epitopi sugli antigeniLa posizione della banda d unastimasemiquantitativadellaconcentrazi one di antigeneREAZIONI REAZIONI DIDI PRECIPITAZIONEPRECIPITAZIONEI mmunoelettroforesiSi unisce la separazione di proteine (antigeni) mediante elettroforesi con la specificit della reazione di immunoprecipitazione:REAZIONI REAZIONI DIDI PRECIPITAZIONEPRECIPITAZIONEU sata per indagini qualitative: nell alterato anabolismo delle IgG (gammapatie mono- e policlonali) nello studio delle anomalie della sintesi proteica (analbuminemia, agammaglobulinemia, ecc)REAZIONI REAZIONI DIDI PRECIPITAZIONEPRECIPITAZIONEREAZIONI REAZIONI DIDI PRECIPITAZIONEPRECIPITAZIONEQ uando un clone di plasmacellule produce una proteina M,si ha una modifica dell'elettroforesi.

9 Una proteinamonoclonale pu migrare ovunque nella regione dellegamma globuline. Le IgM e le IgA tendono a migrare pi velocemente rispetto alle IgG (figure b e c). Perl'identificazione certa della proteina M si pu utilizzarel' 'immunoelettroforesisiavvaledell'applica zionedianticorpiL'immunoelettroforesisia vvaledell'applicazionedianticorpicontro le proteine sieriche gi elettroforeticamente separate:si generano archi di precipitazione dovuti alla reazione traantigene e anticorpo. Se presente una gammopatiamonoclonale, si produrr una modifica dell'arco diprecipitazione sulla banda delle IgA o delle IgG o delle IgM,che permette di riconoscere a quale classe diimmunoglobuline appartiene la proteina (IHC) Tecnica usata per mostrare la presenza di antigeni (per lo pi proteine) nella loroesatta localizzazione in sezioni istologiche di tessuti, preservandone struttura edintegrit , usando una specifica reazione antigene-anticorpo, ed in cuil anticorpo marcato da molte e differenti specie chimiche(essenzialmente enzimi, come HRP oAP,capacidicatalizzareunareazionechimic a)odafluorofori(FITC);AP,capacidicataliz zareunareazionechimica)odafluorofori(FIT C).

10 L immunoistochimica prevede la combinazione dell immunologia e dellamicroscopia, in quanto il complesso antigene-anticorpo deve essere visibile almicroscopio; Usati anticorpi policlonali e IHC di una sezione direne con il marcatore CD10 IHC di tirosin-idrolasi (TH) inverde, negli assoni deineuroniIMMUNOISTOCHIMICAIMMUNOISTOCHI MICAUSO di IHC Antigeni tissutali o di superficie cellulare per la diagnosi di patologie autoimmuni Markers tumorali Tipizzazione tumoraleIMMUNOISTOCHIMICAIMMUNOISTOCHIMI CA Tipizzazione tumorale Marcatori di differenziamento Marcatori agenti infettivi (virus, batteri)Immunofluorescenza (IF)Gli Ab sono marcati con molecole fluorescenti Le molecole fluorescenti assorbono luce a una determinata lunghezza d onda(eccitazione) e la emettono ad un altra lunghezza d onda (emissione); Se gli Ab sono marcati con i fluorocromi, possono essere rilevati attraverso lavalutazione della luce colorata emessa in seguito all eccitazione a unadeterminatalunghezzad onda;IMMUNOFLUORESCENZAIMMUNOFLUORESCENZ A determinatalunghezzad onda; La luce emessa pu essere rivelata con un microscopio a fluorescenza; I coloranti possono essere coniugati alla regione Fc di una molecola senzamodificarne la specificit ; Coloranti: fluoresceina, rodamina, ficoeritrina (CFM) E una tecnica che permette la misurazione e la caratterizzazione di cellule sospesein un mezzo fluido; Rende possibile la misurazione di propriet multiple di singole cellule ad una velocit moltorapida,permettendounadettagliataana lisiqualitativaequantitativa;moltorapida ,permettendounadettagliataanalisiqualita tivaequantitativa; Si basa sull impiego di Ab monoclonali fluorescenti.