TP n°2 : Techniques d’ensemencement et d’isolement des ...

1 R dig par : BELMESSIKH A. et MERGOUD L. Manuel des travaux pratiques de Microbiologie g n rale 2 meann e LMD 1 TP n 2 : Techniques d ensemencement et d isolement des microorganismes 1. Principe L examen microscopique tout seul n est pas suffisant pour caract riser et identifier un germe. Pour cela, il est n cessaire d ensemencer le microorganisme sur des milieux de culture. -Ensemencer : consiste d poser un microorganisme dans un milieu de culture neuve et st rile. -Milieu de culture : est une pr paration permettant aux microorganismes de se multiplier rapidement en grand nombre.

2 Il doit donc satisfaire les exigences nutritives du germe tudi . (apporte la source : d eau, de carbone et d nergie, d azote, de phosphore, d ions min raux, de facteurs de croissance, pH voisin du pH optimal,..). -Selon leurs consistances les milieux de culture se divisent en deux types : Le milieu de culture liquide = le bouillon Le milieu de culture solide = le bouillon + agar-agar (g lose) -L agar-agar ou la g lose : est un polysaccharide extrait de la paroi cellulaire d algues rouges poss dant des propri t s permettant son utilisation pour solidifier (g lifier) les milieux de culture des germes.

3 La g lose se dissout dans l eau 90 C, reste en surfusion jusqu 45 C, puis temp ratures basses forme un gel transparent plus ou moins solide selon la concentration dans l eau. Elle n est pas d grad e par les microorganismes. Les germes se d veloppent parfaitement dans les milieux de culture liquide sous forme d un m lange. Ce qui implique l impossibilit de s parer les microorganismes. Par contre, les milieux de culture solides permettent une croissance des germes avec fixation sous forme des colonies microbiennes s par es, ce qui facilite leur isolement et par cons quent leur purification et identification.

4 Les milieux de culture solides sont utilis s alors pour l isolement microbien. -Colonie microbienne : ensemble de cellules identiques issues de la m me cellule microbienne m re. - Isoler : consiste s parer les divers microorganismes d un m lange poly microbien. - Souche pure ne donnera qu un type de colonies par boite de P tri . 2. Outils d ensemencement Anse de platine, Pipettes Pasteur,.. R dig par : BELMESSIKH A. et MERGOUD L. Manuel des travaux pratiques de Microbiologie g n rale 2 meann e LMD 2 3. Techniques d ensemencement Avant toute manipulation, il faut rassembler tout le mat riel dont on a besoin.

5 On l organise de fa on les avoir dans la zone st rile ( proximit du bec). Selon l objectif vis , on utilisera diff rentes Techniques : ensemencement dans le tube a) ensemencement dans le tube de bouillon -Devant le bec, prendre le tube contenant les microorganismes dans la main gauche, d boucher le et garder le bouchon dans la main droite, ensuite flamber l ouverture du tube. -St riliser l anse dans la flamme du bec et la laisser refroidir. -Plonger l anse dans la suspension bact rienne r alis e partir d une colonie que l on veut identifier ou confirmer.

6 -Prendre une goutte de la suspension. -On la retire sans toucher les parois du tube, l anneau de l anse contient une bulle de suspension avec des germes, c est l inoculum. -Ensuite reflamber l ouverture du tube et remettre le bouchon. -On plonge ensuite l anse dans le tube de bouillon neuf et st rile (apr s flambage de son col). -On l agite sur toute la hauteur afin de r partir la suspension dans tout le milieu. -Reflamber l ouverture du tube ensemenc et refermer le. -Repasser le fil de platine la flamme en le portant au rouge. -Incuber le tube ensemenc dans l tuve.

7 Remarque : On prendra en garde conserver tout les objets dans la zone st rile du bec bunsen et de ne jamais les faire entrer en contact avec la paillasse. Les bouchons des tubes seront pass s la flamme du bec avant et apr s toute manipulation, tout comme les instruments. Dans le cas d utiliser une Pipette Pasteur : La pipette est pass e rapidement dans la flamme. A l aide d une pince st rile, sectionner la pipette la pointe scell e. Aspirer le bouillon de culture. Ensemencer dans les tubes sans souffler. La pipette Pasteur ne sert qu une seule fois. R dig par : BELMESSIKH A.

8 Et MERGOUD L. Manuel des travaux pratiques de Microbiologie g n rale 2 meann e LMD 3 b) ensemencement dans le tube troit de g lose en culot Il est ensemenc gr ce une pipette Pasteur en r alisant un mouvement h lico dal du fond vers la surface, la suspension bact rienne est lib r e progressivement. (test type respiratoire) c) ensemencement dans le tube de g lose en culot L ensemencement se fait par piqure centrale l aide d une pipette Pasteur boutonn e, apr s avoir pr alablement charg celle-ci de suspension bact rienne. (test metaboloique) d) ensemencement dans le tube de g lose inclin e (pente) On utilise l anse charg e de suspension selon le proc d d crit pour le milieu liquide.

9 On r alise des stries espac es sur toute la longueur de la pente en commen ant par le fond du tube et en remontant. (conservation du microorganisme) e) ensemencement dans le tube de g lose semi-inclin e (culot + pente) Le culot est classiquement ensemenc par piqure centrale par pipette Pasteur boutonn e et la pente par stries selon le principe de la g lose inclin e. (test type respiratoire) ensemencement dans la boite de P tri (contient le milieu de culture solide) a) ensemencement en masse (en profondeur) -Incorporer 1 ml de suspension microbienne dans la boite de P tri vide.

10 -Faire couler le milieu de culture en surfusion (45 C). - Faire homog n iser les germes avec toute la masse du milieu. - Laisser solidifier puis incuber. b) ensemencement en double couche -Faire couler une premi re couche 15ml du milieu de culture et laisser solidifier. -D poser 1 ml de la suspension des germes et ensemencer par talement. -Couvrir d une deuxi me couche 5ml du milieu de culture en surfusion (45 C). - Laisser solidifier puis incuber. On cr e alors une zone micro a robie (isolement des ana robies facultatifs). c) ensemencement en surface c-1. Par inondation (utilis e en antibiogramme) -Deux millilitres de suspension microbienne sont d pos s la surface du milieu de culture coul et solidifi.