Extrait du sujets de BTS Biochimiste - fdanieau.free.fr

1 Extrait du sujets de BTS Biochimiste Exercice 1. Structure primaire (10 points). Une cas ine a t s par e et purifi e. Il s'agit d'une prot ine de masse molaire mol culaire 23600. g/mol. Elle pr sente une seule cha ne de 199 acides amin s. L'hydrolyse enzymatique par la chymosine conduit la coupure de plus de 25 liaisons peptidlques. Cette hydrolyse s'effectue pr f rentiellement au niveau des liaisons contenant le groupe carboxyle d'une ph nylalanlne ou d'une leucine. La s quence de l'un des peptides obtenus apr s action de la chymosine - le peptide P - est recherch e. La composition du peptide P en acides amin s est la suivante Arg, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Ser. L'hydrolyse trypsique du peptide P lib re un acide amin x, un tripeptlde T1 (Glu, Gly, Leu) et un pentapeptide T2 (Ile, His, Lys, Met, Ser). L'action du bromure de cyanog ne sur le peptide P conduit la formation d'un t trapeptide BC1 et d'un pentapeptide DC2, pr sentant a son extr mit C terminale : une lactone d'homos rine.

2 L'hydrolyse du peptide P par la thermolysine lib re l'acide amin basique x, un acide amin y et un heptapeptide. Lors de l'action de la carboxypeptldase A sur le peptide P, le d tachement des acides amin s en fonction du temps est le suivant : - apparition de leucine dans les 2 premi res minutes, - apparition de leucine et de glycine dans les 5 premi res minutes. D terminer une s quence possible pour le peptide P. Donn e : Document 2 - sp cificit des processus de clivage dans l'analyse des s quences d'acides amin s - Document 2: SPECIFICITE DES PROCESSUS DE CLIVAGE UTILISES DANS L'AHALYSE DES. SEQUENCES D'ACIDES AMINES. PROCESSUS SITE SPECIFICITE COMMENTAIRE. 1 - Clivages terminaux Clivage d'Edman c t C de l'acide amin Rn = n'importe quel A l'exception des acides N terminal amino-acide amin s N terminaux bloqu s Carboxypeptidase A c t N de l'acide amin Rn = Arg, Lys, Pro C terminal Rn -1 = Pro Carboxypeptidase B c t N do l'acide amin C Rn = Arg, Lys terminal Rn -1 = Pro 2 - Clivages Internes Bromure de c t C de Rn Rn = Met Hautement sp cifique cyanog ne Trypsine c t C de Rn Rn = Lys, Arg Hautement sp cifique Rn - 1 = Pro Chymotrypsine c t C de Rn Rn = Phe, Trp, Tyr, Leu Occasionnellement Rn =.

3 Rn - 1 = Pro Met ou autres acides amin s Thermolysine c t N de Rn Rn = Leu, Ile, Phe, Trp, Occasionnellement Tyr, Val Rn = Ala ou autres Rn - 1 = Pro acides amin s Pepsine c t N de Rn Non sp cifique Rn (r sidu de rang n) : Indique la localisation du clivage. Exercice 2. Structure primaire d'un peptide. La composition en acides amin s d'un peptide P, d termin e apr s hydrolyse acide est: Lys 1; Arg 1; AsX 1; Ser 1; GlX 1; Pro 1; Gly 1; Ala 1; Val 1; Met 2; Ile 1; Phe 1. La charge nette de P est +1 pH 6,4. Apr s traitement de P par le DNFB. on obtient DNP-Ser. L'action de la carboxypeptidase sur P d tache Ile. L'hydrolyse de P par la Trypsine donne 3 oligopeptides dont les compositions en acides amin s d termin es apr s hydrolyse acide sont : T1 Lys 1; GlX 1; Pro 1; Gly 1; Val 1; Met 1. T2 Arg 1; Ser 1; Ala 1; Met 1; Phe 1. T3 AsX 1; Ile 1. T1 absorbe fortement 280nm. La charge nette de T3 a pH 6,4 est -1. L'hydrolyse de P par la Chymotrypsine donne 3 oligopeptides dont les compositions en acides amin s, d termin es apr s hydrolyse acide sont: CT1 Arg 1; Ala 1; Val 1; Met 1.

4 CT2 Lys 1; AsX 1; GlX 1; Pro 1; Gly 1; Met 1; lle 1. CT3 Ser 1; Phe 1. L'hydrolyse de P par le bromure de cyanog ne donne notamment 2 oligopeptides dont les compositions en acides amin s d termin es apr s hydrolyse acide sont: RC1 Arg 1; GlX 1; Ala 1; homos rine lactone 1. RC2 Lys 1; AsX 1; Pro 1; Gly 1; Ile 1. Trait par le r actif de Sanger: BC2 donne DNP Gly. Quelle est la s quence de P? Exercice 3: Formule d velopp e, variation de la charge en fonction du pH et d termination du pHi On donne les peptides suivants : Lys-Ala-His-Glu-Met et Trp-Leu-Asp-Cys. crire la formule d velopp e de ces peptides. tudier la variation de leur charge nette en fonction du pH et d terminer leur pH iso lectrique. On utilisera les valeurs suivantes pour le pK a des diff rentes fonctions ionisables : -COOH ou -COOH -NH2 -NH2 Imidazole Thiol 3 4,5 8,5 10,5 6,5 10. Exercice 4: tude d'un dipeptide. Courbe d'absorbance en fonction du pH. 1. crire la formule du dipeptide alanyl-tyrosine.

5 2. Pr ciser les diff rentes formes ioniques possibles de ce dipeptide en fonction du pH du milieu. On donne les valeurs des pKa 25 T : Tyrosine: pKa1: (-COOH) = 2,20; pKa2 (-NH2) = 9,10; pKa3 (-OH) = 10,10. Alanine: pKa1: (-COOH) = 2,35; pKa2 (-NH2) = 9,70. 3. Application: on mesure la densit optique 25 C et 295nm d'une solution 0,4M d'alanyl- tyrosine diff rents pH: on obtient les r sultats suivants: pH 1,3 4,6 8 9,7 10,2 10,5 12 13 14. DO 295nm 0 0,01 0,08 0,3 0,55 0,68 0,87 0,91 0,91. Tracer la courbe traduisant la variation de la densit optique en fonction du pH. Interpr ter la courbe. (BTS Biochimiste 1974). Exercice 5: Analyse d'un peptide par lectrochromatographie Un chantillon est soumis une lectrochromatographie sur papier ( lectrophor se pH 6,4 suivie d'une chromatographie ascendante en solvant organique). Apr s r v lation la ninhydrine, les spots 1, 3, 4 et 5 apparaissent color s en mauve et le spot 2 en jaune (fig. 1). Les constituants 1 et 3 peuvent galement tre r v l s par des r actifs de la fonction ph nol et le constituant 4 par la r action de Sakaguchi.

6 Figure 1 Figure 2. 1) Quelle peut tre la nature des constituants correspondant aux taches 1, 2, 4, 5? 2) Apr s hydrolyse trypsique de l' chantillon et lectrochromatographie dans les m mes conditions que pr c demment, on obtient la carte repr sent e par la figure 2. Quelle(s) hypoth se(s) peut-on faire sur la nature de 3? 3) L' chantillon est d pos en haut d'une colonne de r sine changeuse de cations faible tamponn e pH 6. L' lution est pratiqu e en augmentant le pH. Dans quel ordre sortiront les diff rents constituants organiques ? Que penser de cette s paration ? (BTS Biochimiste 1977). Exercice 6: Analyse d'un peptide 1) Comment peut-on mettre en vidence la nature peptidique du compos tudi ? 2) L'hydrolyse acide totale et l'analyse chromatographique de l'hydrolysat r v lent que le peptide est constitu d'arginine (Arg), d'alanine (Ala), de valine (Val), de leucine (Leu), de ph nylalanine (Phe) et de tyrosine (Tyr). Quel est le r v lateur utilis pour localiser ces acides amin s sur le chromatogramme ?

7 3) D termination de la formule brute: on d termine la masse molaire du peptide, on l'hydrolyse, on en fractionne les diff rents acides amin s que l'on dose s par ment. On a obtenu la formule brute suivante: (Arg) 1, (Ala) 1, (Val) 1, (Leu) 1, (Phe) 1, (Tyr) 1, c'est un hexapeptide. La m thode l'aminopeptidase montre que l'acide amin NH2 terminal est l'alanine (par convention le r sidu NH2 terminal est plac l'extr mit gauche du peptide). L'hydrolyse trypsique conduit 2 tripeptides dont l'un est constitu d'alanine, arginine et tyrosine. L'hydrolyse acide partielle conduit un m lange de peptides: peptide P1 constitu d'arginine et de ph nylalanine;. peptide P2 constitu de leucine et de valine; peptide P3 constitu de ph nylalanine, de leucine et d'arginine. En d duire la structure du peptide, c'est- -dire sa s quence en acides amin s. La trypsine est sp cifique des liaisons peptidiques impliquant le groupement carboxyle d'une arginine ou d'une lysine.

8 (BTS Biochimiste 1972). Exercice 7: On consid re les oligopeptides suivants: Gly-Arg; Gly-Glu et Gly-Glu-Arg. On proc de une lectrophor se sur papier d'un m lange de ces 3 peptides pH 1 et pH 13. Apr s l' lectrophor se, on r v le les peptides avec la ninhydrine. On obtient 2 taches pour chaque lectrophor se. Ces taches sont localis es comme le montrent les figures 1 et 2: Laquelle des figures correspond l' lectrophor se pH 1, laquelle l' lectrophor se pH 13? Quel lectrophor gramme obtiendrait-on pH 7? Exercice 8: On soumet une s quence polypeptidique une hydrolyse acide totale, l'action des carboxypeptidases A et B, la r action de Sanger (DNFB) et l'hydrolyse par la Trypsine. L'hydrolysat acide contient 1 Gly, 1 Glu, 1 Lys, 1 Leu, 1 Met, 1 Asp, 1 Arg, 1 Phe, 1 His et 1 Pro. Les carboxypeptidases A et B sont sans effet. La r action de Sanger suivie d'hydrolyse totale conduit DNP-Gly et DNP-Lys. Apr s action de la trypsine on obtient 4 fragments: - un t trapeptide (1) qui donne avec le DNFB la DNP-Leu et la DNP-Lys; par ailleurs, (1) est trait.

9 Avec BrCN; les produits de la r action sont s par s; parmi eux figure un dipeptide non charg en milieu neutre;. - un tripeptide (2): apr s r action avec le DNFB suivie d'hydrolyse, le m lange des aminoacides est s par par chromatographie sur r sine changeuse de cations, pH 3; un des trois aminoacides n'est pas retenu par la r sine et se retrouve dans les premi res fractions de l' luat;. les aminoacides qui ont r agi avec le DNFB sont la Gycine et la Lysine;. - un dipeptide (3): la r action de Sanger r v le la pr sence de DNP-Asp; en outre, il donne une r action de Sakaguchi positive;. - le 4e fragment (4) donne avec le DNFB la DNP-Gly; la chymotrypsine hydrolyse ce fragment en 2. dipeptides. Apr s action du BrCN sur le polypeptide on retrouve 2 peptides: l'un contenant Gly, Glu, Leu et Lys, l'autre tous les aminoacides restants. tablir la structure primaire de la s quence polypeptidique. Exercice 9: On donne le peptide suivant : Trp-Gly-Asp-Lys.

10 1. crire la formule d velopp e de ce peptide. 2. tudier la variation de sa charge nette en fonction du pH et en d duire la valeur de son pH. iso lectrique. Donn es : pKa des diff rents groupements ionisables : pK1 pK2 pK3. Acide Aspartique 2,09 9,82 3,86. Glycine 2,34 9,6. Lysine 3,18 8,95 10,53. Triptophane 2,38 9,39.