Imunofluorescência direta e indireta - SciELO

1 An Bras Dermatol. 2010;85(4):490-500. Imunofluoresc ncia direta e indireta *Direct and indirect immunofluorescenceVal ria Aoki 1 Joaquim X. Sousa Jr 2L gia M. I. Fukumori 3 Alexandre M. P rigo 4 Elder L. Freitas 5 Zilda N. P. Oliveira 6 Resumo:A imunofluoresc ncia um valioso instrumento auxiliar no diagn stico das dermatoses bolhosasautoimunes e desordens inflamat rias, uma vez que seus achados cl nicos e histopatol gicos podem n oser determinantes. Consiste em um m todo laboratorial fact vel, que requer profissionais t cnicos experi-entes, e detecta imunocomplexos in situ e/ou circulantes, que podem estar envolvidos na patog nese detais enfermidades cut : Autoimunidade; Imunofluoresc ncia; Membrana basal; P nfigoAbstract: Immunofluorescence is a valuable auxiliary diagnostic tool for autoimmune bullous diseasesand inflammatory disorders, since their clinical and histopathologic findings may be inconclusive.

2 It is afeasible laboratory method that requires experienced technicians and detects in situ and circulatingimmune deposits that may be involved in the pathogenesis of such skin diseases. Keywords: Autoimmunity; Basement membrane; Fluorescent antibody technique; PemphigusAprovado pelo Conselho Editorial e aceito para publica o em * Trabalho realizado no Departamento de Dermatologia, Laborat rio de Imunopatologia Cut nea, Faculdade de Medicina da Universidade de S o Paulo (USP) - S o Paulo (SP), de interesse: Nenhum / Conflict of interest: NoneSuporte financeiro / Financial funding: CNPq-processo 303493/2008-9 e CNPq-processo 803070 1 Professora doutora, Departamento de Dermatologia, Faculdade de Medicina da Universidade de S o Paulo (USP) - S o Paulo (SP), , Departamento de Dermatologia, Faculdade de Medicina da Universidade de S o Paulo (USP) - S o Paulo (SP), , Laborat rio de Imunopatologia Cut nea, Faculdade de Medicina da Universidade de S o Paulo (USP) - S o Paulo (SP), , Laborat rio de Imunopatologia Cut nea, Faculdade de Medicina da Universidade de S o Paulo (USP) - S o Paulo (SP), do Programa Integrado de Bolsas de Inicia o Cient fica (PIBIc), Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient fico e Tecnol gico (CNPq).

3 Acad mico da Faculdade de Medicina da Universidade de S o Paulo (USP) - S o Paulo (SP), doutora, Departamento de Dermatologia, Faculdade de Medicina da Universidade de S o Paulo (USP) - S o Paulo (SP), Brasil. 2010 by Anais Brasileiros de Dermatologia490 REVIS OINTRODU OAs rea es imunol gicas que envolvem aliga o ant geno-anticorpo podem ser visualizadas ouquantificadas por meio de diferentes marcadores parao ant geno ou para o anticorpo. Entre os marcadoresmais comumente empregados, podem-se citar osfluorocromos, as enzimas e os compostos radioativose prim rdios da imunofluoresc ncia direta (IFD)datam de 1942, quando Albert Coons e a marca o de anticorpos antipneu-mococos com fluoresce na no tecido fluorocromos s o corantes que absorvemradia o (luz ultravioleta), s o por ela excitados eemitem luz vis vel.

4 Para que funcionem comomarcadores, necessitam possuir grupos qu micoscapazes de formar liga es covalentes com mol culasprot icas, emitindo alta fluoresc ncia no espectrovis vel com colora o distinta da emitida pelostecidos. Devem ter uma conjuga o relativamentesimples, reten o da atividade do anticorpo naprote na marcada e estabilidade do conjugadofluorescente obtido. Um dos fluorocromos maisutilizados o isotiocianato de fluoresce na (FITC), decor verde, que tem um pico de absor o de 490l e deemiss o de 520l. A rodamina, outro agente utilizadona IFD, de cor vermelha, possui picos distintos deabsor o e de emiss o (520l e 610l). O microsc pioutilizado para a leitura de IFD pode ser deepiluminesc ncia ou leitura das rea es de imunofluoresc ncia(IF), devem-se enumerar tr s formas distintas defluoresc ncia: espec fica, n o espec fica e auto-fluoresc ncia.

5 A fluoresc ncia espec fica deve-se rea o entre o substrato e a prote na marcada com ofluorocromo (rea o ant geno-anticorpo). Afluoresc ncia n o espec fica deve-se colora o dostecidos por corante livre ou prote nas fluores-ceinadas, ou ambos. A autofluoresc ncia ocorredevido fluoresc ncia natural dos tecidos (amarela,azul), quando expostos luz imunofluoresc ncia foi introduzida naDermatologia na d cada de 60, quando Beutner eJordon, por meio dessa t cnica, revelaram anticorpostanto no tecido como circulantes nas dermatosesvesicobolhosas autoimunes, especialmente, nos p nfigosvulgar (PV) e foli ceo (PF)4-5e penfigoide bolhoso (PB).6 Atualmente, os estudos de imunofluoresc ncias o determinantes no diagn stico laboratorial dasdermatoses bolhosas autoimunes, mas tamb mdesempenham importante papel na investiga o deoutras enfermidades, como: dermatoses inflamat rias(l pus eritematoso, l quen plano, porf rias, vasculites).

6 A - IMUNOFLUORESC NCIA direta O melhor local e o tempo de evolu o dasles es cut neas para realizar bi psia para o exame deimunofluoresc ncia direta (IFD) dependem daenfermidade em investiga o. Em termos gerais, abi psia deve ter uma extens o adequada (punch4mm), bem como uma profundidade que representeepiderme e derme suficientes. Al m disso, quantomenor for o traumatismo realizado durante oprocedimento, melhor ser a amostra para an seguintes locais para bi psia s orecomendados:Nas dermatoses vesicobolhosas autoimunes, omelhor local a regi o perilesional;Nas colagenoses, deve-se realizar bi psia nales o ativa em evolu o (evitar les es recentes, commenos de 60 dias).

7 Nas vasculites, deve-se dar prefer ncia a les esrecentes com at 24 horas de evolu s o procedimento, o material pode serimediatamente congelado em nitrog nio l quido oucolocado no meio de transporte adequado, o meio composto de sulfato de am nio, N-etil-maleimida e sulfato de magn sio em um tamp ocitrato, que permite a conserva o do esp cime porat duas esp cime , ent o, seccionado em umcriostato, em fragmentos de quatro micra de cada sec o aplicam-se os anticorpos anti-humanosprim rios conjugados fluoresce na FITC (anti-IgA,anti-IgG, anti-IgM e anti-C3) e realiza-se a leitura atrav sdo microsc pio de fluoresc ncia (Figura 1).31. Epit lioH dois padr es de fluoresc ncia intraepitelial: afluoresc ncia intercelular, t pica dos p nfigos, e afluoresc ncia no n cleo dos queratin citos (FAN in vivo),observada, em geral, nas doen as do tecido Fluoresc ncia intercelularTodas as formas de p nfigo caracterizam-se pelaperda da ades o celular, levando acant lise.

8 Essaperda de ades o resulta em forma o de bolhaintraepid rmica, e o n vel de clivagem permitediferenciar as duas formas principais de p nfigo:vulgar e foli ceo. No p nfigo vulgar (PV), a clivagem suprabasal, enquanto que, no foli ceo (PF), secaracteriza por ser intramalpighiana. A IFD revelafluoresc ncia intercelular, de padr o linear,intraepid nfigo foli ceo Os achados de IFD no p nfigo foli ceo cl ssico(PF) e no end mico (PFE) apresentam as mesmascaracter sticas. Autoanticorpos da classe IgG dirigem-se contra a desmogle na 1 (Dsg1), o principalautoant geno no p nfigo foli ceo. IFD:Encontram-se dep sitos de IgG e C3intercelulares ao longo de toda a epiderme (Figura2A) em 100% dos casos na doen a da classe IgG depositam-se, tamb m,no epit lio escamoso oral, apesar da aus ncia deles es cl nicas de PFE nas ,12 Subclasses deIgG podem ser empregadas, revelando que, empacientes com les es de PF ativas, o is tipo de IgGmais predominante a IgG4, em contraste com aIgG1, mais encontrada nos doentes em remiss nfigo vulgar Autoanticorpos da classe IgG depositam-se napele e no epit lio escamoso oral.

9 No p nfigo vulgar(PV) com les es exclusivas de mucosa, osautoanticorpos da classe IgG dirigem-se, geralmente,contra a desmogle na 3 (Dsg3), um autoant geno demaior express o nas por es inferiores da h les es mucocut neas, os doentes de PVpodem, tamb m, apresentar anticorpos contra a Dsg1e indicar pior progn stico da doen semelhan aImunofluoresc ncia direta e indireta491An Bras Dermatol. 2010;85(4) : Imunofluoresc ncia diretado PF, les es de PV ativas apresentam IgG4, emcontraste com os doentes em remiss o, nos quais h predom nio de :Dep sitos de IgG e C3 intercelulares,estes ltimos com localiza o predominante nascamadas inferiores dos epit lios (Figura 2B) no PVcom envolvimento mucoso, em 100% dos casos dedoen a nfigo herpetiformeO p nfigo herpetiforme (PH) uma variante doPV ou do PF, em que, clinicamente, se evidenciamp pulas e ves culas agrupadas, pruriginosas, quelembram a dermatite herpetiforme.

10 Os achados de IFDs o semelhantes ao PF ou PV, ou seja, deposi o deIgG intercelular ,16P nfigo paraneopl sicoO p nfigo paraneopl sico (PNP) umadermatose bolhosa de progn stico grave, descrita porAnhalt e col. em 1990. O quadro envolve pele e mucosase h associa o com neoplasias (tumor de Castleman,linfomas, timomas). Exibe muitas semelhan as com oPV, mas apresenta diversidade de autoant genos(reatividade com a desmogle na 3, desmoplaquinas eant genos da zona da membrana basal - ZMB).17 IFD:Padr o semelhante ao PV, mas comocasionais dep sitos homog neos de IgG e C3 nazona de membrana basal (Figura 2C).Uma das formas de se diferenciar o PNP do PV a realiza o da IF indireta (IFI), utilizando-se comosubstrato o epit lio vesical murino (epit lio n oestratificado simples, transicional)18(V.)