Los cultivos celulares y sus aplicaciones II (cultivos …

1 Los cultivos celulares y sus aplicaciones II ( cultivos de c lulas vegetales) Lic. Mar a Eugenia Segret n INGEBI-CONICET - Dpto. FBMyC, FCEyN-UBA El t rmino gen rico cultivo de tejidos vegetales involucra a diferentes t cnicas de cultivo de material vegetal diverso, incluyendo a los protoplastos (c lulas desprovistas de su pared celular), c lulas, tejidos, rganos y plantas completas. Mediante stas y otras t cnicas de cultivo, es posible obtener plantas libres de microbios en un medio nutritivo as ptico (est ril) en condiciones ambientales controladas. Tambi n se lo conoce como cultivo in vitro de plantas por realizarse en recipientes de vidrio (hoy tambi n de otros materiales).

2 Las primeras experiencias relacionadas con el cultivo de tejidos vegetales se remontan a 1902, pero reci n en 1922 se logr el primer experimento exitoso: la germinaci n in vitro de semillas de orqu deas. Luego de la germinaci n, las pl ntulas obtenidas se transfirieron a un medio de cultivo en condiciones as pticas, y as se mantuvieron protegidas del ataque de pat genos (hongos, virus y bacterias). Hoy esta t cnica tiene numerosas aplicaciones , algunas de ellas se ilustran en la Figura 1: Propagaci n masiva de plantas , especialmente para especies de dif cil propagaci n por otros m todos, o en v as de extinci n Clonaci n de individuos de caracter sticas agron micas muy deseables durante todo el a o Obtenci n de plantas libres de virus Producci n de semillas sint ticas Conservaci n de germoplasma (conjunto de individuos que representan la variabilidad gen tica de una poblaci n vegetal) Obtenci n de metabolitos secundarios Producci n de nuevos h bridos Mejora gen tica de plantas (incluyendo obtenci n de plantas transg nicas)

3 Germinaci n de semillas. Producci n de haploides. Estudios fisiol gicos diversos. Figura 1. Algunas aplicaciones del cultivo de tejidos en plantas. A la izquierda, micropropagaci n de violeta africana a partir de trozos de hojas desinfectados e introducidos en condiciones de esterilidad. A la derecha, semillas sint ticas formadas por embriones som ticos obtenidos por cultivo de c lulas, encapsulados en una matriz inerte (como el alginato de calcio). Fotograf a tomada de Las bases biol gicas del cultivo de tejidos: la totipotencialidad celular La reproducci n asexual de plantas por cultivo de tejidos es posible gracias a que, en general, varias c lulas de un individuo vegetal poseen la capacidad necesaria para permitir el crecimiento y el desarrollo de un nuevo individuo completo, sin que medie ning n tipo de fusi n de c lulas sexuales o gametas.

4 Esta capacidad se denomina totipotencialidad celular, y es caracter stica de un grupo de c lulas vegetales conocidas como c lulas meristem ticas, presentes en los distintos rganos de la planta . La potencialidad de una c lula diferenciada (una c lula de conducci n, epid rmica, etc.) para generar tejidos nuevos y eventualmente un organismo completo, disminuye con el grado de diferenciaci n alcanzado por esa c lula, pero puede revertirse parcial o completamente seg n las condiciones de cultivo a las que se la someta. Las c lulas vegetales crecidas en condiciones as pticas sobre medios de cultivo adicionados con hormonas vegetales, pueden dividirse dando dos tipos de respuesta.

5 Una desdiferenciaci n celular acompa ada de crecimiento tumoral, que da lugar a una masa de c lulas indiferenciadas denominada callo, la cual bajo las condiciones adecuadas es capaz de generar rganos o embriones som ticos (llamados as porque son estructuras similares a un embri n, pero que no se originaron por uni n de gametas), una respuesta morfogen tica por la cual se forman directamente rganos (organog nesis) o embriones (embriones som ticos). La primera respuesta se conoce como organog nesis o embriog nesis indirecta (mediada por un estado de callo) mientras que la segunda respuesta se considera organog nesis o embriog nesis directa.

6 El cultivo in vitro consiste en tomar una porci n de una planta (a la que se denominar explanto, como por ej. el pice, una hoja o segmento de ella, segmento de tallo, meristema, embri n, nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un medio nutritivo est ril (usualmente gelificado, semis lido) donde se regenerar n una o muchas plantas. La formulaci n del medio cambia seg n se quiera obtener un tejido desdiferenciado (callo), crecer yemas y ra ces, u obtener embriones som ticos para producir semillas artificiales. El xito en la propagaci n de una planta depender de la posibilidad de expresi n de la potencialidad celular total, es decir, que algunas c lulas recuperen su condici n meristem tica.

7 A tal fin, debe inducirse primero la desdiferenciaci n y luego la rediferenciaci n celular. Un proceso de este tipo sucede durante la formaci n de las ra ces adventicias en el enraizamiento de estacas, la formaci n de yemas adventicias, o cuando se busca la propagaci n de begonias, violeta africana (ver figura 1) o peperonias mediante porciones de hojas. Uno de los factores m s importantes a tener en cuenta para lograr la respuesta morfogen tica deseada es la composici n del medio de cultivo. No existen dudas que en todo intento de propagaci n vegetal, ya sea in vitro o in vivo, el car cter del proceso de diferenciaci n depende del genoma de la especie, y que est regulado por el balance hormonal propio y por el estado fisiol gico del rgano, tejido o c lula puesta en cultivo.

8 Sin embargo, tambi n se sabe que ese balance puede ser modificado por el agregado de compuestos que imiten la acci n de las hormonas vegetales. Estos compuestos se denominan reguladores del crecimiento, y se emplean en los medios de cultivo para conseguir la micropropagaci n de una planta . La totipotencialidad celular es clave en el desarrollo de plantas gen ticamente modificadas o transg nicas. Una vez realizada la transformaci n, ya sea por Agrobacterium o por el m todo de biobal stica, el paso siguiente es el cultivo in vitro, con el fin de obtener, a partir del explanto inicial transformado, pl ntulas que lleven el transg n en todas sus c lulas (Figura 2).

9 Figura 2. Cultivo de tejidos y transformaci n vegetal. En la figura se observan explantos que, luego del proceso de selecci n, han perdido coloraci n y aquellas c lulas transformadas exitosamente que se han desdiferenciado y rediferenciado para dar origen a un brote. Pasos necesarios para generar plantas a partir de explantos aislados En los protocolos utilizados durante el cultivo in vitro se pueden distinguir las siguientes etapas (sintetizadas en la Figura 3): 1) Elecci n de la planta y/o tejido donante de explantos. 2) Establecimiento, que consiste en la desinfecci n de los explantos (generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptaci n al medio artificial de modo de inducir callo, brote, ra z o embri n som tico seg n se desee.

10 3) Multiplicaci n, para generar una masa vegetal suficiente para la regeneraci n del n mero de plantas necesarias. 4) Enraizamiento, en la que se busca la formaci n de ra ces con el fin de convertir los brotes o embriones som ticos en pl ntulas completas. 5) Rusticaci n, que es la aclimataci n de las pl ntulas obtenidas in vitro a las condiciones ambientales ex vitro (suelo o alg n sustrato inerte) El xito de la t cnica depende de muchos factores, entre ellos la edad de la planta (a mayor edad, menor potencial de regeneraci n), el genotipo y las condiciones ambientales.