TECHNIQUES: Principes de la chromatographie

1 11 TECHNIQUES: Principes de la chromatographie2D finitionLa chromatographie est une m thode physique de s parationbas e sur les diff rentes affinit s d un ou plusieurs compos s l gard de deux phases (stationnaire et mobile).L' chantillon est entra n par la phase mobile au travers de la phase stationnaire qui a tendance retenir plus ou moins les compos s de l' chantillon l'aide de diff rentes interactions. L chantillon est adsorb puis d sorb sur la phase stationnaire, ou est plus ou moins solubledans la phase mobile. 23 Types de chromatographiesTypeCrit re de s parationAdsorptionPolarit PartageSolubilit ExclusionTaille des mol cules changeuse d ionsCharge ioniqueAffinit Structure des prot inesIl est rare de pouvoir associer une m thode chromatographique un seul ph nom de chromatographiesChromatographie changeuse d ionsChromatographie d exclusion35 Chromatographies d adsorptionPhase mobileNomGazChromatographie en phase vapeur (CPV) ou en phase gazeuse (GC)LiquideChromatographie couche mince (CCMou TLC) ou clairLiquideChromatographie liquide haute performance (CLHP ou HPLC)

2 6 Utilit de la chromatographieSelon la quantit de produit appliqu en chromatographie , on s en sert pour: Analyser< 1 mg de produit par CCM, HPLC ou CPV S parer ou purifierles produits d une r action par chromatographie clair ou HPLC (50 mg 15 g) Doserdes produits. L analyse quantitative se fait avec un talon interne ou apr s pr paration d une courbe de calibration. 47 chromatographie d adsorption: principeLa chromatographie d adsorption est bas e sur le partage des solut s entre l adsorbant solide fixeet la phase mobile. Chacun des solut s est soumis une force de r tention par adsorption et une force d entra nement par la phase mobile.

3 L quilibre qui en r sulte aboutit une migration diff rentielle des solut s de l chantillon analyser, cequi permet leur s s paration sont bas es sur le principe de polarit , c est- -dire l existence de dip les dans une structure mol possibles (du moins polaire au plus polaire):Papier, cellulose, amidon, carbonate de sodium, gel de silice, alumine, charbon activ .8 AdsorbantsLes adsorbants sont sous forme de granules calibr s. La s paration est meilleure, mais plus lente si les grains sont fins. Plus un adsorbant est actif, plus il retient fortement les compos s polaires. La s paration se fait par ordre croissant de leurs forces d interaction avec les compos s des groupements fonctionnels neutresLe gel de silice est polaire, il a par cons quence une plus grande affinit pour les compos s polaires:Un compos peu polaire est peu adsorb.

4 Un compos polaire est tr s adsorb .R-HR-XR-NO2 RORRORORRORHORNR2 OROHOR-NH2 R-OH Ar-OHPolarit croissanteLes mol cules charg es ne migreront habituellement pas sur gel de silice, elles sont trop mobileUne phase mobile liquide est appel e luant. C est elle qui fait migrer les compos s, son choix est donc important. Il faut que le solut soit solubledans l est possible de faire des m langes de solvants pour changer sa polarit .Polarit croissanteHexanesCCl4 Benz ne, Tolu neEt2 OCH2Cl2 AcOEtMeOH, EtOHAcOH611 Deux facteurs interviennent lors de l interaction entre l luantet le solut (m lange de compos s s parer): la solubilit : on doit tre en mesure de dissoudre le solut dans l luant pour que la migration se fasse.

5 La polarit de l luant va d terminer quelle vitesse le compos un compos est polaire, moins il s accroche l adsorbant, plus il migre avec l d un luant peu polairePlus un compos est polaire, plus il s accroche l adsorbant, moins il migre avec l luant. Choix d un luant polaireChoix de l luant12 chromatographie sur couche minceL adsorbant (silice, 250 m d paisseur) est fix sur une plaque (Al, verre) commercialement produit/m lange de produits est d pos sur la plaque l aide d un produits sont r v l s apr s paration d un capillaireAu laboratoire, les capillaires sont pr par s au d part de pipettes Pasteur: Chauffer la partie centrale de la pipette dans la flamme d une torche au propane en tournant le tube jusqu ce qu il soit mou.

6 Retirer de la flamme et tirer la pipette. Laisser refroidir et couper la partie fine du des analytiques(250 m, x cm) V rifier la puret d un produit, quelques microgrammes suffisent Suivre l avancement d une r action V rifier l efficacit d une extraction liquide-liquide D terminer l luant pour la chromatographie clair sur gel de silice2. CCM pr paratives(1000 m, 20 x 20 cm) Purification de petites quantit s de produit (jusqu ~100 mg sur une plaque de 20 x 20 cm). La bande qui contient le produit purifi est gratt e, puis la silice est extraite avec un solvant. 815Pr paration de la CCMABC1.

7 On trace un trait ~1 cm du bord inf rieur de la marque les futur d p ts, espac s d environ identifie chaque produit qu on fera Le produit/m lange doit toujours tre dilu dans un solvant (Et2O, CH2Cl2, ) assez un vial, d poser 1 goutte ou 2-3 cristaux de produit + ~ mL lution de la CCM3. On utilise un capillaire pour d poser le produit sur la plaque puis on laisse vaporer le solvant. On peut spotter 2-3 fois si l chantillon est tr s dilu .4. lution: pr parer une cuve d lutionavec B cher de 250 mL avec un papier absorbant l int rieur Verre de montreY verser 10 mL d luant (ex. 8 mL Hex + 2 mL AcOEt)Placer la CCM dans la cuve en veillant ce que la ligne soit au-dessus du luer jusqu ~5 mm du bord et tracer un trait pour marquer le front de v lation de la CCM l il nu: si le produit est color la lampe UV: les mol cules qui absorbent les UV 254 nm seront visibles (noyaux aromatiques par exemple).

8 Avec un r v lateur chimique:l iode est le premier r v lateur tester, car il est non destructif. Il permet de r v ler des doubles liaisons et les halog nures. L iode est vapor chaud ou dans la hotte. De nombreux autres existent: KMnO4, acide phosphomolybdique, vanilline, KMnO418 Mesure du RfProduit moins polaire, moins accroch Produit plus polaire, plus accroch 1et 0 entrevaleur solvantdefront du Hauteur migration deHauteur RfLe Rf(rapport frontal ou r tention frontale) est caract ristique d un produit dans un luant donn et pour une phase stationnaire donn e. Ll1l21019 Influence de l luantLorsque la polarit du solvant augmente, le Rfaugmente.

9 Le Rfaugmente, puis diminue. Pour faire une s paration de deux produits par chromatographie , on cherche un luant qui donne le plus grand Rfpossible, avec un Rfpour le produit le moins polaire autour de 0, de l luant100% Hexane95% Hex ane5% AcOEt90% Hexane10% AcOEt80% Hexane20 % Ac OE t70 % Hex ane30% AcOEt20 CCM bidirectionnellesC est une exp rience qui permet de prouver si un produit d compose sur la silice, ou si un spot de la CCM contient en fait deux produits. Si lu dans un autre solvant