Transcription of Cours de Biologie Moléculaire et Génie Génétique
1 Cours de Biologie Mol culaire et G nie G n tique Dr. Abdelhakim Aouf Destin aux tudiants de 3e ann e Licence de Microbiologie 2015-2016 - 1 R publique Alg rienne D mocratique et Populaire Minist re de l'Enseignement Sup rieuret de la Recherche Scientifique Universit Ferhat Abbas-S tif1 Life begins with cells and cellbeginswith the secret of life: " DNA" * DNA begins with fournucleotidesand nucleotide begins with five atoms: "H, C, O, N, P" * Atoms begins with electrons,protons, neutrons and other substructures * So, Try to understand Life _____Sommaire P A G E Premi re partie Biologie Mol culaire Chapitre I Support de l'information g n tique 1 1 Introduction 1 2 ADN comme mat riel g n tique 1 3 Composition chimique de l'ADN 2 4 Structure de l'ADN 4 5 Interactions entre C-G et A-T 5 5-1 Liaison hydrog ne 5 5-2 Stabilisation de la double h lice de l'ADN 5 6 Formes de l'ADN 5 7 Propri t s physico-chimiques de l'ADN 7 7-1 Temp rature de fusion 7 7-2 Facteurs influen ant la Tm 8 7-3 Absorption de la lumi re ultraviolette 8 Chapitre II Expression de l'information g n tique 9 1 Transcription 9 1-1 G ne 10 1-2 ARN polym rase 10 1-3 tapes de la transcription chez les procaryotes 12 1-3-1 Initiation 12 1-3-1-1 S quences consensus 13 1-3-1-2
2 Fixation de l'ARN polym rase 13 1-3-1-3 l ments trans 13 1-3-2 Elongation 13 1-3-3 Terminaison 14 1-4 Transcription chez les eucaryotes 16 1-4-1 tapes de la transcription chez les eucaryotes 17 1-4-1-1 Initiation 17 1-4-1-2 Elongation 19 1-4-1-3 Terminaison de la transcription 20 1-5 Maturation des ARNm 20 1-5-1 Ribozymes 21 1-5-2 Splic osome 22 2 Traduction 24 2-1 ARN messager et le code g n tique 24 2-1-1 Code g n tique 25 2-1-2 Reconnaissance, l'activation et le chargement des ARNt 25 2-2 Ribosomes 27 2-3 R les des ARN dans la traduction 28 3 tapes de la traduction chez les procaryotes 29 3-1 Initiation de la traduction 29 3-2 longation 31 3-3 Terminaison de la traduction 34 4 Traduction chez les eucaryotes 34 4-1 Initiation de la traduction chez les eucaryotes 34 4-2 longation 37 4-3 Terminaison de la traduction 37 Chapitre III R gulation de l'expression g n tique 38 1 Introduction 38 2 R gulation de l'activit enzymatique 39 2-1 Retroinhibition (Feed Back or end-product inhibition)
3 40 2-2 Modification covalente des enzymes 42 3 Prot ines se liants l'ADN 44 3-1 Structure des prot ines se liant l'ADN 44 4 R gulation transcriptionnelle 45 4-1 Contr le n gatif de la transcription "R pression et induction" 46 4-1-1 R gulation de l'expression de l'op ron lacZYA 46 4-1-2 R gulation de l'expression de l'op ron argCBH 49 4-2 Contr le positif de la transcription 50 4-2-1 R gulation de l'expression de l'op ron malEFG 50 5 R gulon 50 6 R gulation positive et n gative de l'op ron araBAD 50 7 Contr le de l'expression g n tique par att nuation 51 8 R gulation par des facteurs sigma ( ) alternatifs 53 9 D tection du quorum (quorum sensing: QS) 53 10 Contr le de l'expression g n tique par un syst me de r gulation deux composants 55 11 ARN de r gulation et les riboswitch 56 11-1 Riboswitchs 57 2epartie G nie g n tique Glossaire 58 Pr ambule 61 CHAPITRE I Enzymes de restriction et de modification des acides nucl iques 62 1 Enzymes de restriction 62 1-1 Nomenclature des enzymes de restriction 62 1-2 Classification des enzymes de restriction 65 1-3 Enzymes de restriction utilis es en g nie g n tique 65 1-4 Utilisation des endonucl ases de restriction pour tablir la mappe de restriction (restriction mapping)
4 66 1-5 Isoschizom res et famille d'enzymes 67 1-4 M thylation de l'ADN 68 1-4-1 Dam m thylase 68 1-4-2 Dcm m thylase 68 2 Enzymes de modification des acides nucl iques 69 2-1 Ribonucl ases A (RNase): EC 70 2-2 D soxyribonucl ase I (DNase I): EC 70 2-3 Nucl ase S1 : EC 71 2-4 Exonucl ase de phage : EC 72 2-5 Exonucl ase III: EC 72 2-6 Ribonucl ase T1: EC 72 2-7 Ribonucl ase T2: EC 73 2-8 Nucl ase Bal31 73 2-9 ADN ligase EC 74 CHAPITRE II H tes de clonage 76 1 L'h te id al 76 2 M thodes d'introduction de l'ADN cloner dans la cellule h te 77 2-1 lectroporation 77 2-2 Un canon Particules ou Biolistics 77 2-3 Microinjection 77 CHAPITRE III Vecteurs de clonage 79 1 Vecteurs bact riens 79 1-1 Plasmides 79 1-1-1 Plasmide pBR322 (Vecteur de premi re g n ration) 80 1-1-1-1 Caract ristiques du plasmide pBR322 81 1-1-2 Vecteurs de seconde g n ration 81 1-2 Bact riophage 83 1-2-1 Principales tapes de la construction d'un vecteur phagique 85 1-3 Bact riophage M13 86 1-4 Cosmides 87 1-5 Phagmides ou phasmides 89 1-6 Chromosomes artificiels bact riens (Bacterial ArtifecialChromosomes)
5 BAC 89 2 Chromosomes artificiels des levures (Yeast Artifecial Chromosomes) YAC 90 3 Chromosomes artificiels d riv de P1 "PAC" 90 4 Plasmide Ti 91 5 Vecteur sp cifiques 92 5-1 Vecteurs navettes et d'expression 92 6 R gulation de la transcription des vecteurs d'expression 93 7 Traduction de g nes clon s 93 8 Expression de g nes de mammif res chez les bact ries 93 9 Production d'insuline par g nie g n tique 94 Chapitre IV Techniques de Biologie mol culaire 96 1 Extraction et purification des acides nucl iques 96 1-1 Source d ADN cloner 96 1-2 Pr paration de l'ADN partir du sang total 97 1-2-1 Protocole exp rimental 98 1-2-2 Dosage des acides nucl iques 98 2 Electrophor se 99 2-1 Introduction 99 2-2 D finition 99 2-3 D termination de la taille des fragments 100 3 Hybridation des acides nucl iques
6 101 3-1 Formules utilis es pour calculer la Th 102 3-2 Facteurs influen ant l'hybridation 102 3-3 Types d hybridation 102 3-3-1 Hybridation d ADN sur support solide : SOUTHERN BLOT 102 3-3-2 Hybridation in situ sur chromosome 103 3-3-3 Hybridation sur colonie de bact ries, sur plage de lyse 103 4 R action de Polym risation en Cha ne "PCR" 104 4-1 Historique 104 4-2 tapes de d amplification de l ADN par PCR 104 4-3 Thermocycleur 105 4-4 Applications et la sensibilit de la PCR 106 5 S quen age 107 5-1 M thode de Sanger 107 5-2 Marquage des produits d'extension 108 5-3 S quen age d'un produit de PCR 109 6 ADN C " ADN compl mentaire" 109 6-1 Caract ristiques de l'ARNm eucaryote 109 6-2 Synth se de l'ADNc 109 6-3 Insertion de l ADNc dans un vecteur appropri 112 3e Partie Introduction la bioinformatique 113 1 Introduction 113 2 Historique 113 3 Banques de donn es biologiques 113 4 Principes de bases de l'alignement des s quences 114 4-1 Alignement et d termination du score 115 4-2 Alignement
7 Global 116 4-2-1 Algorithme de Needleman et Wunsch 115 4-3 Alignement local 117 4-4 BLAST (acronym de: Basic Local Alignment Search Tool ) 117 4I-5 Alignement de s quences multiples 119 4-5-1 ClustalW / ClustalX "Cluster alignment" 119 4-5-1-1 tapes de l'alignement multiples de type clustal 119 6 Arbres phylog n tiques 119 6-1 M thode des distances (UPGMA: Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) 119 6-2 M thode de parcimonie (Maximum Parcimony) 120 6-3 M thode de maximum de vraisemblance (Maximum Likelihood- ML) 120 7 Recherche de motifs et de domaines 121 8 Pr diction et mod lisation mol culaire 121 8-1 Pr diction de structures secondaires 121 8-2 Mod lisation mol culaire 122 R f rences bibliographiques 124 Premi re partie: Biologie Mol culaire 1 Chapitre I Support de l'information g n tique Objectifs - Exp riences ayant conduit la d couverte de l'ADN comme mat riel g n tique.
8 - Composition chimique de l'ADN. - Structure de l'ADN. - Caract risation et analyses de l'ADN. 1-Introduction La vari t des organismes vivants est extraordinaire, on estime qu'il ya de nos jours plus de 10 millions d'esp ces. Chaque esp ce est diff rente des autres. Cette diff rence est due au contenu en information g n tique de chaque esp ce. Les g n ticiens ont envisag que des mol cules sp cifiques taient porteuses de cette information g n tique. Les tres vivants sont subdivis s en deux groupes: les eucaryotes et les procaryotes, se diff rencient par la pr sence ou non d'un noyau. 2-ADN comme mat riel g n tique En 1869: Fredrich Micher utilisa une prot ase (pepsine: d couverte en 1836) pour s parer le noyau du cytoplasme.
9 Il a observ une petite tache de poudre grise qui s' tait d tach e d'un liquide claire jaun tre (cytoplasme). Il l'appela nucl ine. En 1889: Le biologiste Altman a pr cis que la nucl ine c'est un acide nucl ique. En 1928 : L exp rience de Griffith a montr e que la souche S tu e ne tue pas la souris, mais lorsqu'elle est m lang e avec la souche R vivante, la souris inject e meurt(fig. 1). Comme conclusion la souche R est transform e en souche S, et le facteur transformant est l'ADN. : Exp rience de F. Griffith en 1928 (Prescott , 2002). 2 En 1931: J. Hammerling, il travaille sur l Acetobularian qui est une algue unicellulaire, verte ayant l'aspect d'une petite ombrelle (tige + chapeau). Il existe plusieurs formes selon le type d'algues.
10 - Il a mis les noyaux d'une souche de type A dans une souche de type B (diff rent chapeaux) dont les chapeaux furent coup s. - Il a observ que des chapeaux de type A se d veloppent sur le type B. Les travaux de Hammerling ont d montr pour la premi re fois dans l'histoire que le noyau est le seul responsable de la production des tres vivants (eucaryotes). En 1944: Avery , Macleod C. M. et Mc Carty M. (Rockfeller institute - New York) ont repris les exp riences effectu s en 1928 par Fred Griffith en utilisant les extraits de diff rentes biomol cules de la cellule S trait s ou non par des enzymes sp cifiques. Les r sultats obtenus montrent qu'il ya transformation d'un nombre de souches R en souche S lorsque l'ADN purifi est utilis (selon la fr quence de transformation).
