Dosage des protéines

1 /analyschim/ JF Perrin maj nov 2011/2013 page 1/3 Dosage des prot ines totales d'un chantillon3 basiques de laboratoireLes m thodes de Dosage des prot ines totales sont nombreuses et pr sentent chacune des caract ristiquesdiff rentes : sensibilit , interf rents, r ponse plus ou moins diff rente selon la composition en acides amin s .. Lechoix d'une m thode d pend donc du contexte. Citons quelques m thodes : par l 'interm diaire du Dosage de l 'azotetotal prot ique, par mesure de l 'absorbance intrins que 280 nm, par m thodes photom triques apr s mise en uvre d'une r action chimique ou de la fixation d'un colorant .. Dans la suite, on se propose de doser des chantillons prot iques selon 3 m thodes : absorbance intrins que 280 nm, photom trie 540 nm apr s r action du biuret, photom trie 562 nm apr s r action au Cu(II) et r v lation l'acide bicinchoninique (m thode dite au BCA)1. Dosage des prot ines totales par mesure d'absorbance 280 nmLa m thode est d crite dans le document annexe n aliser le spectre de la s rumalbumine bovine en solution en NaCl 0,15M entre 230 et 350 nm.

2 Commenter le spectre. Calculer le rapport A280 , si cela vous para t possible, les prot ines totales des extraits enzymatiques pr par s lors des s ances pr c dentes par mesures d'absorbances 280 Dosage des prot ines par m thode du biuretLa m thode est d crite dans le document annexe n la m thode en microplaque 96 puits en utilisant les donn es du document n 2 et du tableau ci-dessous compl ter. Mesurer les prot ines totales des extraits enzymatiques pr par s lors des s ances pr c SAB 5mg/mL en NaCl 0,15 M0 NaCl 0,15 MR actif de Gornall200 LProt ines par tube r actionnel (q en g)0 Recouvrir la plaque. Homog n iser sur agitateur de plaques, incuber 40 minutes 37 C puis remettre temp rature les absorbances (A) entre 540 et 590 nm contre le TR. talonnage A= f(q) par r gression lin aire. talonner en : chantillon doser qsp L plus L de r actif de Dosage des prot ines par m thode au BCALa m thode est d crite dans le document annexe n en uvre la m thode en microplaque 96 puits en utilisant les donn es du document n 3.

3 Mesurer les prot ines totales des extraits bruts enzymatiques r alis s lors des s ances pr c dentes (sur 20 L non dilu et sur20 L dilu au 1/10 en NaCl 9g/L) et des extraits partiellements purifi s (volumes essais 20 L). Pr voir les t moins de compensation chantillon n Compte-renduCompte-rendu technique puis conclusion g n rale (comparative).BibliographieE. Layne, Methods in Enzymology, 1957, III, Tsuyoshi Ohnishi, Barr, Methods in Enzymology, vol. xx (1978). Deutscher, Methods in Enzymology, vol. 182 (1990).Smith, et al., Anal. Biochem., 150, 76-85, (1985).Peterson G. L., Anal. Biochem., (1977) 83, , VAJDOS, FEE, GRIMSLEY, GRAY, How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein, Protein Science (1995), 4 Protein Methods and Their Potential Utility to Reduce the Risk of Food Protein Adulteration, Moore .., Comprehensive Reviews in Food Science and FoodSafety, 2010, vol. 9(4), 330-357/analyschim/ JF Perrin maj nov 2011/2013 page 2/3 Document n 1.

4 Dosage des prot ines totales et absorbance intrins que 280 nmMost proteins have relatively intense ultraviolet light absorption centered at 280 nm. This is due totyrosinyl and tryptophanyl residues in the protein. However, the amount of these residues varies in differentproteins and the mass absorption coefficient varies in different proteins : 0 to Lg-1cm-1 ( for bovineserumalbumin, for human IgG, for lysozyme ..). If no extinction coefficient information exists for aprotein or protein mixture of interest, a rough estimate of the mean mass absorption coefficient is Lg-1cm-1 fora solution that has no other interfering non-protein components (ie nucleic ) that absorbs ultraviolet light will interfere with the assay must not be , Christian and Layne developed methods to correct for the interference with nucleic acids, whichwould be common contaminants in a protein extract (nucleic acids adsorb strongly at 280 nm, max = 260 nm).

5 Layne equationUnknowns with possible nucleic acid contamination. Use the following formula to estimate protein concentration :Concentration (mg/ml) = ( x A280) - x A260) Protein estimation by UV absorption. Protein concentration (mg/mL) = A280*F (E. Layne, Methods in Enzymology, 1957, III, 447) A280 , n 2. Dosage des prot ines par la m thode dite du biureta) PrincipePour toute cha ne polypeptidiques contenant au moins 2liaisons peptidiques, les liaisons peptidiques forment, en milieutr s alcalin, un complexe color avec les ions Cu2+. Si on meten uvre un r actif standardis , en exc s, on peut ainsi doserles prot ines par colorim trie 540 r actif standardis utilis est appel r actif de Gornall (laconcentration en Cu2+, en OH- est standardis e, il contient duKI : 1,5 g de CuSO4, 5 H2O pour 6 g de tartrate double desodium et de potassium et 30 g de NaOH et 1 g de KI).(La mol cule de biuret donne la m me r action que lesliaisons peptidiques avec les ions Cu2+, c est pourquoi lam thode a t appel e m thode du biuret.

6 B) Qualit s de la m thodeM thode de mise en uvre tr s simple et tr s peu on m thode poss de une sensibilit influenc e par la nature (composition en aminoacides) des prot ines doser : il y a par exemple un effet proline, hydroxyproline et cyst ine r el !. La m thode est malheureusement peusensible. Elle n est applicable qu des milieux tr s concentr s en prot ines (plus de 0,8 mg/mL). C est justement lecas du plasma sanguin ! D o son utilisation en analyses m tr s nombreuses substances portant des fonctions amines ou amides interf rent avec la r action de Dosage (voir la litt rature sp cialis e). Cependant les interf rents s riques sont n gligeables, d o l utilisation en analysesm ) Modes op ratoires Le mode op ratoire type est le suivant :- Echantillon doser ou talon qsp 1 mL avec une solution de NaCl 9 g/L. 0,8 10 mg de prot ines par tube. (Les dilutions ventuelles des solutions prot iques sont r alis es en NaCl 9 g/L.

7 - r actif de Gornall 4 mL (r actif tr s stable) ;- homog n iser, attendre 30 minutes l obscurit et lire au spectrophotom tre 540 m thode est videmment adaptable en microplaque JF Perrin maj nov 2011/2013 page 3/3 Document n 3 Dosage des prot ines par la m thode dite au BCAa) Principe En milieu alcalin, les prot ines r duisent C2+ en Cu+. Le selde l'acide bicinchoninic (BCA) forme un complexe color mesurable 562 nm avec les ions Cu+.b) Qualit s de la m thodeM thode compatible avec la plupart des surfactants jusqu' 5%. M thode influenc e par la composition en acides amin s des prot ines mesur es :facteur 1 3. M thode r aliser en dur e contr l e (cin tique complexe, volution dans le temps).Les ch lateurs de Cu(II), donc l'EDTA, les agents r ducteurs (thiols, vitamine C ..) et les solutions tr s haut pouvoir tampon interf rent. Voir par exemple pour les interf les r actifs le domaine de praticabilit de la m thode est du type 0,1-2 mg/mL ou 0,01-0,2 ) Modes op ratoiresLe mode op ratoire avec un r actif standard est le suivant :EtalonnageTR12345 talon s rum albumine bovine 1 mg/mL en NaCl 0,15mol/L020 L40 L60 L80 L100 Leau100 L80 L60 L40 L20 L0R actif Cu2+/BCA du jour 2 mLQuantit de prot ines par tube r actionnel (q)020 g40 g60 g80 g100 gHomog n iser, couvrir et incuber 2 heures temp rature ambiante ou 30 min 37 les absorbances (A) 562 nm contre le TR.

8 Etablir la relation d' talonnage A=f(q) par r gression lin : chantillon doser qsp 100 L plus 2 mL de r actif Cu2+ mode op ratoire en microplaque 96 puits et le r actif standard est le suivant : talonnage en triplicate TR12345 talon s rum albumine bovine 0,5mg/mL en NaCl 0,15 mol/L 04 L8 L12 L16 L20 Leau20 L16 L12 L8 L4 L0R actif Cu2+/BCA du jour200 LQuantit de prot ines par tube r actionnel (q)Recouvrir la plaque. Homog n iser au moins 5 minutes sur agitateur de plaqueet incuber 2 heures temp rature ambiante (30 minutes 37 C).Lire les absorbances (A) entre 540 et 590 nm contre le TR. tablir la relation d' talonnage A= f(q) par r gression lin : chantillon doser qsp 20 L plus 200 L de r actif Cu2+ alisation du r actif Cu2+/BCA du jour. R actif A : solution commerciale standard pour Dosage des prot ines au BCA (1g/L en sodium bicinchoninate, 20 g/L en Na2CO3,H2O, 1,6g/L sodium tartrate 2H2O, 4g/L NaOH, 9,5 g/L NaHCO3, Sigma B9643 ou autre fournisseur videmment) ; R actif B : CuSO4,5H2O 4% ; M langer 50 V de r actif A (BCA) plus 1 V de r actif B = r actif Cu2+/BCA, stable la journ e.

9 A savoir, il existe des r actifs plus concentr s en BCA (40g/L) avec des modes op ratoires diff rents et plus sensibles (praticabilit 0,01 0,2 mg/mL) !