Espectrometria de Massas (MS)

1 21/10/20151 Espectrometria de Massas (MS) lvaro Jos dos Santos NetoCROMA-IQSCD isciplina: SQM0418 -An lise Instrumental IIUniversidade de S o PauloInstituto de Qu mica de S o CarlosDepartamento de Qu mica e F sica Molecular2 semestre de 2015 Espectrometria de MassasOutline: Introdu o Sistemas de v cuo Fontes de Ioniza o Analisadores de massa Resolu o e Exatid o de Massa Detectores MS/MS21/10/20152O que a Espectrometria de Massas ?O que faz a MS?Como funciona a MS?Em que a MS pode ser til?Misturas em MS21/10/20153 Combinando a cromatografia com a MSCompara o entre cromatogramade LC-UV e LC-MS (modo TIC)21/10/20154O pico cromatogr fico em MSCont m toda a informa o de MS:-Espectro completo (TIC)- ons selecionados (SIM)Ou toda a informa o de MS/MS:-Rea es espec ficas (SRM)-Perda neutra (neutral loss)- ons precursores- ons produtosO Espectro de Massas on base on molecular ons fragmentos21/10/20155O Espectro de Massas on base on molecular protonadoAdutos ?

2 Diferentes termos em MS Massa nominal:a massa calculadapara um on levando em conta a massa inteira do is topo mais abundante de cada elemento. Massa monoisot pica:a massa calculadaa partir da massa exata do is topo mais abundante de cada elemento. Massa do on mais abundante:a massa correspondente ao pico ( on) mais intensodentro do conjunto de picos isot picos de um mesmo composto. Massa m dia: a m dia ponderada de todos os picos isot picos de um determinado termos em MSEtapas na an lise por o dos o/Separa o dos ons de acordo com m/z* oOBS: etapas 2 e 3 necessitam de v cuo (etapa 1 apenas em alguns casos, GC-MS)* Apesar do termo Espectrometria de Massas , sempre se mede o valor de Ioniza o2. An lise/separa oFonte: Detec oDiagramas de blocos de um MSALTO V CUOI nterface / Fonte de onsAnalisadorde MassasDetectorALTO V CUOI nterface / Fonte de onsAnalisadorde MassasDetectorModo de Ioniza o Press o Atmosf rica (API)Modo de Ioniza o no V cuoIntrodu o dos analitos(sistema de cromatografia)Introdu o dos analitos(sistema de cromatografia)Exemplos: EI, CI, PI, MALDI, TSI, FAB, SIMS, FI/FDExemplos.

3 ESI, APCI, APPI, AP-MALDI, DESI, DART, EASI21/10/20159 Sistemas de v cuoBomba rotativa (roughingou rotary)Sistemas de v cuoBomba turbomolecular21/10/201510 Esquema de um equipamento GC-MSTiposde componentesparaum espectr metrode massasFontede onsAnalisadorDetectorSistemade Dados Direta GC LC SFC IC CE DLI ICP Solid probeInterfaceIntrodu oda amostra EI CI ESI APCI MALDI FAB Thermospray Particle BeamSistema de V cuo:DP or TMP Biblioteca Quadrupolo Setor TOF FT-ICR Ion Trap Orbitrap MS/MS Q/TOF, TOF/TOF HRMS LRMS10 5~ 10 8torr21/10/201511 Fontes de ioniza o para MSFontes de ioniza o para GC-MS Ioniza o por el trons EI( Impacto de el trons termo obsoleto*) Ioniza o Qu mica CI Modo positivo Modo negativo* de EI Filamentoaquecido Energia: 70 eV Ioniza ointensa hard ionization Rea esemEI Ioniza o/ Excita o Forma ode onmolecular Fragmenta oem on+ radical Fragmenta oem onradicalar+ perdaneutra21/10/201513 Algunsmecanismosnaforma odos onsAnalito= + e-* A++ B-+ + e-* A++ B + + e-* [AB+ *] + 2e-, seguidopor: [AB+ *] AB+ - + e-* [AB2+*]" + 3e-, seguidopor.

4 [AB2+*]" A++ B+-pequenaabund + e-* AH* + e-, seguidopor: AH* + AH [AH+H]++ A-- autoioniza oqu mica O processo de ioniza o em GC-EI-MS21/10/201514O processode fragmenta oemGC-EI-MSEspectrode massasporEI (70 eV) de duascetonasisom ricascom composi oC6H12O21/10/201515 Fonte de CI Similar fontede EI, por mcom g sreagente(metano, isobutanoe am nia)e energiamaisalta. Ioniza obranda(soft ionization)Eletroioniza odo g sreagenteRea o entre o on e a mol cula do g s reagente1)Transfer nciade pr tonForma o de adutosSubtra o de hidrog nio2)Forma o de ons reagentesRea o com os analitosGases reagentespara CIMetano: bompara a maioriados compostosorg nicos usualmenteproduzadutosde [M+H]+, [M+CH3]+e [M+C3H5]+ osadutosn os osempreabundantes fragmenta orazo velIsobutano: usualmenteproduzadutosde [M+H]+, [M+C4H9]+e algumafragmenta o osadutoss orelativamentemaisabundantesque emCI com metano n o t ouniversal quantometanoAm nia.

5 Fragmenta ogeralmenteausente compostospolaresproduzemadutos[M+NH4]+ compostosb sicosproduzemadutos[M+H]+ compostosn opolarese n ob sicosn os oionizados21/10/201516EI vs. CIMM = 226 DaM(C2H5)+Fontes de ioniza o para o LC-MS Ioniza oporelectrospray ESI(eletronebuliza o) ModoESI puro ModoESI com assist nciapneum tica atualmenteo maisusado Ioniza oQu micaa Press oAtmosf rica APCI Fotoioniza oa Press oAtmosf rica APPI21/10/201517 Escolhendo o modo de ioniza o ESI:solutos i nicos e polares (MM 100 -150x103daltons).Mol culas maiores adquirem mais que uma carga. APCI:solutos de polaridade m dia e n o-polares (MM 100-2000 daltons). APPI:mesmos solutos que APCI mas resposta melhor para mol culas de menor LC-ESI-MS Melhor op o para an lise cidos e bases fracas Mais compat vel com baixas vaz es21/10/201518 Electrospray ESI (puro)Electrospray -ESI21/10/201519 Electrospray ESIVaz es: 100 nL/mina 5 L/minESI com assist ncia pneum tica( IonSpray )Vaz es: 5 L/min a 0,2-1,0 mL/min21/10/201520 Electrospray ESIVaz es: at 3 mL/min(Fonte: Turbo V T at 750 C)21/10/201521 Electrospray ESIF onte de ioniza o: Z-Spray source Ioniza o Qu mica a Press o Atmosf rica(APCI)Vaz es.

6 ~1,0 mL/min21/10/201522Sa da HPLCG s de nebuliza oNebulizador (sprayer)Vaporizador (aquecedor)G s de secagemCapilarL mpada UVAgilentTechnologies, , o a Press o Atmosf rica(APPI) Pode ser usado um dopanteEx. Tolueno Escolha da t cnica de ioniza o est intimamente relacionada ao modo de separa o em lise de benzo[a]pireno;100 picomoles; modo positivo; inje o em abund ncia do on [M+H]+em m/z253. on [M+H]+mais abundantePresen a de M+em m/z252Is topo C13em m/z 254 Abund ncia 5 x maior que APCI e 20 x maior que Technologies, , de ioniza o para MS(/MS)Massa MolecularApolarPolaridadeMuito PolarFonte: AgilentTechnologies, , 2001.(GC) EI(GC) CIMALDI21/10/201524 Analisadores para MS Setor Magn tico e Setor Eletrost tico Quadrupolo Ion Trap Tempo de Voo FT-ICR (FT) Orbitrap21/10/201525(Da) m/m(ppm)Amos-tragemQ< < a ~ 200$$ / $$ = Reflec.

7 < < a ~ 200~ 10$$$puls.< ~ < 10$$$$cont.< a < 5$$$puls.< > < 5$$$$ bridos Instrumentospara TandemMS Triplo Quadrupolo(QqQ) Ion Trap (IT) Convencional(IT 3D) Linear (LIT ouIT 2D) Q-ToF/ IT-ToF Qq-LIT LIT-Orbitrap LIT-FTICR21/10/201526 TANDEM-IN-SPACE ex. QqQEsquema de um instrumento do tipo triplo quadrupolo (QqQ)FonteMS1 Colis oMS2 Detector TANDEM-IN-TIME ex. Ion TrapEsquema de um instrumento do tipo Ion Trap MS/MSFonteLentesDetectorAnalisador21/10/ 201527MS/MS (sequencial)MSnonde nindica o n mero de est gios de MSPrinc pio de opera o21/10/201528-Espectro dos produtos ou ons filhos Modos de opera oMS1 Est ticoMassa do precursor (pai)C mara de colis oFragmenta o CIDModo RF (passam todas as Massas )MS2 ScanEspectrodos produtos( onsfilhos)-Espectro dos precursores ou ons pais Modos de opera oMS1 ScanEspectrodos precursores(pais)C mara de colis oFragmenta o CIDModo RF (passam todas as Massas )MS2 Est ticoMassa do produto(filho)21/10/201529-Monitoramento de Rea es Selecionadas (SRM)Modos de opera oMS1 Est ticoMassa do precursor (pai)

8 C mara de colis oFragmenta o CIDModo RF (passam todas as Massas )MS2 Est ticoMassa do produto(filho)Ex: Monitoramento da transi o: m/z609 m/z195 para a O:SRM n oresultaemespectro!21/10/201530LC-MS/MSL C-MS-Especificidade-Rela o S/NSIM vs. SRMMS1 Scanm/z = XC mara de colis oFragmenta o CIDModo RF (passam todas as Massas )MS2 Scanm/z = X -A-Perda Neutra (constante)Modos de opera o21/10/201531 Resumo de modos de opera oMS1 Cela de colis oMS2 Espectrodos onsprodutosSelecionaprecursor RF apenasvarreduraEspectrosdos onsprecursoresvarreduraSelecionaprodutoS RMS elecionaprecursor SelecionaprodutoPerda NeutraSincronizadoMS2 SincronizadoMS1-Alta especificidade, precis o e exatid o;-Alta detectabilidade, principalmente no modo SRM, tornando poss vel a quantifica o de esp cies em baix ssimos n veis de concentra poss vel a an lise de misturas :baixa resolu o (necessitando de uma separa o cromatogr fica eficiente) e limitado 2 est gios de an lise de Massas (MS2).

9 Vantagens do QqQ21/10/201532 MRM (frente) x SIM (atr s)MercaptobenzotiazolSIM: m/z 166 MRM: m/z 166 134 MercaptobenzoxazolSIM: m/z 150 MRM: m/z 150 58 Trends Anal. Chem.,2001, 20, Aplica oTempo de Reten o, minutosAnalisadores h OrbitrapFusionFonte: #tab:schematic21/10/201533 Analisadores para MS SetorMagn ticoe SetorEletrost tico Quadrupolo Ion Trap Tempo de Voo FT-ICR (FT) OrbitrapDefini esde resolu oemMS Resolu ode Massa (Mass Resolution)vs. Poderde Resolu ode Massa (Mass Resolving Power RP)FWHM = Full Width at Half Maximum(Larguratotal da metadedo pico)Ex.: 10% do vale m/z m/z21/10/201534 Defini esde exatid oemMS Massa exata (exactmass) = massa isot pica calculadavs. Massa acurada (accuratemass) = massa medida com a exatid o do equipamentoErroda medida(Dm)= mmedida mexata(mDa)Graude Exatid o(Degree of accuracy)= 106x m/mexata(ppm)21/10/201535 ExemploN2+CO+m/z = 28,006148 m/z = 27,994915 m = 0,011233 Requergraude exatid ode pelomenos200 ppmRP (10% vale) (FWHM) para MS SetorMagn ticoe SetorEletrost tico Quadrupolo Ion Trap Tempo de Voo FT-ICR (FT) Orbitrap21/10/201536 Setor Magn tico e Setor Eletrost tico (Focaliza o Dupla)Focaliza o Dupla Vantagens Alta resolu o e exatid o Excelente estabilidade = resultados quatitativos Desvantagens Caro --Dif cil de usar Velocidade de varredura limitada (histerese)

10 Detectabilidade dependente da velocidade21/10/201537 QuadrupoloFonte: o de AC e DC21/10/201538 Trajet riade onemmovimentoharm nico21/10/201539 Trajet riade onemmovimenton oharm deMassas Mass Range m/ztempoTempo de scanTempo de perman ncia Dwell time Incremento Step size Modo Scan21/10/201540m/ztempoPer odo da an liseTempo de perman ncia Dwell time ..Modo SIMC aracter sticas de um Quadrupolo m/z < 4000 Da/e Baixo RP: 1000-4000 (FWHM) geralmente 0,7 a 1,0 Da Grau de Exatid o: 100 a 200 ppm Baixo custo Velocidade de varredura razo vel Velocidade de varredura influencia na detectabilidade21/10/201541 Quadrupolo Aprisionador de ons -IontrapIon trap21/10/201542 Ion trapVarredura do potencial V21/10/201543 Varredura do potencial VIon traplinear -LIT Geralmente usado em equipamentos h bridos21/10/201544 m/z < Da/e RP: 1000 a 5000 (FWHM) Geralmente 0,7 a 1,0 Da Grau de Exatid o.