Manuel des Travaux Pratiques de Bactériologie

1 2019-2020. Manuel des Travaux Pratiques de bact riologie Dr. BOUSSENA SABRINA. Institut des Sciences V t rinaires D partement de Productions Animales 2019-2020. Table des mati res AVANT-PROPOS . 1. TP. N 1 : LABORATOIRE DE BACTERIOLOGIE .. 2. 1. Types de laboratoires de bact riologie .. 2. Niveaux de confinement . 3. Niveau de confinement 1 3. Niveau de confinement 2 3. Niveau de confinement 3 4. Niveau de confinement 4 4. 2. Laboratoire de bact riologie m dicale de l'ISVK : les diff rents locaux de travail et les postes de manipulation) . 5. 3. R gles suivre durant les Travaux Pratiques . 6. 4. Les consignes de s curit . 6. 5. Consignes de propret .. 8. 6. Pr sentation de l'endroit de travail et du mat riel . 9. 7. Pr sentation et organisation des postes de manipulation st rile et de coloration.

2 9. Organisation de poste de manipulation st rile .. 9. Organisation de poste de coloration .. 10. 8. Ensemencement et mise en culture des bact ries 11. 9. Pr paration et utilisation des milieux de culture 12. Pr paration des milieux en poudre .. 13. Types de milieux de culture .. 13. Milieu s lectif 13. Milieu lectif .. 14. Milieu ordinaire . 14. Milieu enrichi . 14. 10. La st rilisation .. 15. Chaleur s che 15. Chaleur humide . 15. Autres proc d s de st rilisation .. 16. TP. N 2 : LES ETAPES DU DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE : I. Premi res tapes du diagnostic bact riologique ( tude des caract res morphologiques et culturaux) . 17. 1. Etude des caract res culturaux 17. 2. Etude des caract res morphologiques 19. Etat frais .. 19. Mode op ratoire .. 19. Observation au microscope 20.

3 Techniques de coloration simple : bleu de m thyl ne .. 20. Technique . 20. Observation .. 20. Techniques de coloration complexe : Coloration de Gram .. 20. Technique . 21. Observation .. 21. TP. N 3: LES ETAPES DU DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE (suite) : II. Etude des caract res biochimiques .. 22. 1. Pr paration de la suspension bact rienne . 22. 2. Recherche de l'enzyme respiratoire 23. Test de catalase .. 24. Test d'oxydase . 24. Nitrate r ductase .. 25. 3. Quelques milieux d'identification de galerie classique. 28. Milieux pour l' tude des m tabolismes prot ique, glucidique et nerg tique .. 28. Production d'ur ase (m tabolisme prot ique) 28. Milieu Kligler Hajna .. 29. Milieu Clark et Lubs . 31. Test RM (rouge de m thyle) 31. Test VP (Vosges-Proskauer) .. 31.

4 Citrate de Simmons . 32. Mannitol-Mobilit .. 33. 4. Galeries de tests biochimiques miniaturis s (galerie Api) 34. Choix de la galerie .. 35. Mode op ratoire .. 36. Lecture et interpr tation des r sultats .. 38. TP. N 4: ANTIBIOGRAMME . 41. 1. D finition .. 41. Limites de l'antibiogramme . 42. 2. Antibiogramme par dilution 42. Choix du milieu . 42. Pr paration de l'inoculum .. 43. 3. Antibiogramme par diffusion . 44. Pr paration de l'inoculum .. 45. Choix des disques d'antibiotiques . 46. Choix du milieu . 47. Mode op ratoire .. 48. Ensemencement par couvillonnage .. 48. Ensemencement par inondation 48. Application des disques .. 49. Lecture et interpr tation .. 50. 4. E-test . 54. 5. Association d'antibiotiques 55. REFERENCES 56. Manuel des Travaux Pratiques _____ Dr.

5 BOUSSENA. AVANT-PROPOS. Le pr sent Manuel constitue un recueil des Travaux Pratiques de bact riologie destin non seulement aux tudiants pr parant leur dipl me de docteur v t rinaire mais aussi aux enseignants de l'Institut des Sciences V t rinaires. Afin de s'assurer que les membres de l' quipe de bact riologie conservent, compl tent et am liorent leurs comp tences et ont acc s des outils appropri s pour les guider lors des Travaux Pratiques , nous avons soigneusement mis en place ce document avec l'essentiel des connaissances et des techniques requises en bact riologie . Concernant la formation des tudiants v t rinaire, ce Manuel vise aussi apporter, les connaissances sur un ensemble de Pratiques r alis es dans le laboratoire afin d'identifier les bact ries pathog nes issues de divers pr l vements provenant d'animaux de compagnie ou de rente.

6 Ainsi, quatre s ries de Travaux Pratiques ont t tablies avec toute la rigueur n cessaire ainsi que l'adaptabilit exig e par les circonstances (laboratoire p dagogique) et les disponibilit s (milieux de cultures et r actifs) du laboratoire de bact riologie m dicale de l'Institut des Sciences V t rinaires. Un premier TP intitul "Laboratoire de bact riologie " traite les consignes de s curit , l'organisation et les quipements ainsi que les principales manipulations de base exerc es au niveau du laboratoire de bact riologie m dicale. Il est noter que les diff rentes parties abord es dans cette section ont t pr sent es tout en accordant une importance particuli re la protection du manipulateur sans compromettre la qualit des r sultats. Un deuxi me et un troisi me TP r unirent les renseignements relatifs aux tapes du diagnostic bact riologique et les crit res tudier afin d'identifier des bact ries pathog nes en particulier d'int r t v t rinaire pr alablement isoler au sein du laboratoire.

7 Dans un dernier et quatri me TP, l' tude de la sensibilit des bact ries aux antibiotiques (r alisation de l'antibiogramme, lecture et interpr tation des r sultats) a t pr sent e d'une mani re traduisant l'importance de ce test dans la pratique v t rinaire. Enfin, il s'av re judicieux de pr ciser que les renseignements contenus dans le pr sent document ne sont pas exhaustifs ; elles feront l'objet de r visions, et toute suggestion susceptible d'am liorer le contenu sera accueillie avec grand int r t. 1. Manuel des Travaux Pratiques _____ Dr. BOUSSENA. TP. N 1. LABORATOIRE DE BACTERIOLOGIE : Structure, organisation et manipulation Objectifs : familiariser les tudiants avec un laboratoire de bact riologie m dicale, son quipement et son fonctionnement. Le laboratoire de bact riologie m dicale v t rinaire r alise l' tude bact riologique des pr l vements provenant d'animaux infect s.

8 Ce qui permet : - De confirmer le diagnostic d'infection. - De d terminer quelle est l'esp ce ou les esp ces bact riennes responsables de cette infection. - De d terminer quels antibiotiques ces bact ries sont sensibles c'est- -dire avec quels antibiotiques il faudra traiter l'animal pour le gu rir de son infection. 1. Types de laboratoires de bact riologie Les laboratoires de bact riologie (ou encore de microbiologie ou de biologie) sont principalement orient s vers la manipulation d'agents biologiques pathog nes ou non. Les manipulations sont r alis es dans des laboratoires dits de confinement (1- 4) pour les substances pathog nes (cf. niveaux de confinement). En bact riologie courante, les techniques mises en uvre peuvent avoir divers buts. En bact riologie m dicale, le but est d'effectuer l'isolement et l'identification des bact ries pathog nes travers : - l'examen microscopique : lecture au microscope optique de lames (mise au point).

9 D' tat frais et de colorations (Bleu de m thyl ne, Gram). - l'isolement sur milieux de culture bact rienne. - la reconnaissance des caract ristiques d'une culture bact rienne (caract res culturaux). - la reconnaissance des caract ristiques biochimiques d'une culture bact rienne. En plus, la lecture et l'interpr tation des r sultats des tests de sensibilit aux antibiotiques (antibiogramme) sont couramment r alis es au sein du laboratoire de bact riologie m dicale. En bact riologie alimentaire, l' valuation quantitative et qualitative d'une ventuelle pollution et m me dans des conditions particuli res, la mise en vidence de bact ries potentiellement pathog ne sont les principaux objectifs recherch s. 2. Le contr le de qualit (contr le de st rilit , contr le de qualit de substances inhibant (antibiotiques par ex.))

10 Ou favorisant la croissance bact rienne fait galement partie des missions des laboratoires de bact riologie . Niveaux de confinement Selon le risque issu des bact ries isol es, il existe 4 niveaux de s curit biologiques (confinement) : Niveau de confinement 1. Ce niveau de confinement concerne le laboratoire de base pour la manipulation des agents du groupe de risque 1 (aucune conception sp ciale, pas d'enceintes de s curit biologique (hotte flux laminaire). Agents du groupe de risque 1 : Agents biologiques peu susceptibles d'infecter une personne saine ou un animal sain. Ils pr sentent un risque faible pour l'utilisateur et la collectivit . Niveau de confinement 2. Ce niveau de confinement est adapt la manipulation des agents du groupe de risque 2. Les principaux risques d'exposition li s des organismes devant tre manipul s en niveau de confinement 2 sont l'ingestion, l'inoculation et l'exposition de membranes muqueuses.)