Pruebas Bioquímicas - UNAM

1 Pruebas bioqu micasDeterminan la actividad metab lica de una cepa pura. Son empleadas principalmente la identificaci n y clasificaci n de bacterias y hongos. Pruebas bioqu micasSe pueden resumir en los siguientes puntos: Sustrato (contenido en el medio de cultivo) Enzima o v a metab lica (secretada o en el interior del microorganismo) Producto Revelador y/o indicador (aunque algunas no los emplean)E + S ES E + PE + S E + S ES ES E + PE + PLos fundamentos completos de estas Pruebas y dem s informaci n pueden encontrarlos en el libro: Pruebas bioqu micas para la identificaci n de bacterias de importancia cl nicade Jean F. MacFaddin, Editorial M dica lisis del Almid nAgar Almid n Sustrato: Almid n (pol mero de glucosa).Enzima: Amilasa (exoenzima).Producto: : Lugol. El lugol con el almid n forman un complejo color caf 4p rpura que desaparece cuando el almid n ha sido almid n es producido principalmente por plantas superiores, est compuesto de amilosa y amilopectina.

2 Diversas enzimas amilol ticashidrolizan almid n y sus negativa prueba positivaDegradaci n de la case naPrueba negativa prueba positivaAgar Leche DescremadaSustrato: Case na (prote na).Enzima: Caseinasa (Proteasa, exoenzima).Producto: Amino : No requiere. Las proteasas son excretadas al medio para la degradaci n de prote nas, la case na es la prote na de la leche que le confiere el color blanco, cuando la case na es hidrolizada desaparece el color blanco alrededor del crecimiento lisis de la lecitina y reducci n del teluritoAlgunos microorganismos producen lecitinasa que hidroliza la lecitina (fosfol pido). Se utiliza el agar yema de huevo. Las colonias productoras de lecitinasa forman una zona opaca a su medio de Baird Parker es empleado para el aislamiento y cuantificaci n de estafilococos cuagulasa positivos, al que se adicionan componentes que lo hacen selectivo. Las colonias t picas de S.

3 Aureusson oscuras por la reducci n del telurito, adem s presentan el halo de hidr lisis de la yema de huevo/Agar Baird ParkerSustrato: : : : No n de la gelatinaGelatina NutritivaSustrato: Gelatina (prote na).Enzima: Gelatinasa (Proteasa, exoenzima).Producto: Amino : No requiere o puede emplearse el carb n activado en polvo. La gelatina es una prote na que tiene la capacidad de gelificar, cuando es hidrolizada por la gelatinasa en los amino cidos que la componen pierde su caracter stica de gelificar. Se pueden emplear varios medios que permiten la visualizaci n macrosc pica como la gelatina adherida a carb n negativa prueba positivaFermentaci n de carbohidratosMedio base rojo de fenol m s carbohidrato o polialcohol, con campana de fermentaci n (Durham).Sustrato: Carbohidrato o a: : cidos org : Cualquier indicador de compuestos de carbono (carbohidratos o polialcoholes) deben ser incorporados, algunos requieren de ser degradados en mon meros y transportados a la c lula para posteriormente en condiciones anaerobias ser metabolizados por la v a fermentativa.

4 La fermentaci n (degradaci n) de un compuesto org nico se observa por la acidez en el medio de cultivo y la formaci n de gas capturado en la campana de fermentaci (A)/Positivo(AG)Oxidaci n/Fermentaci nLas bacterias utilizan hidratos de carbono por uno de dos procesos metab licos, fermentativo u oxidativo. La principal diferencia es la necesidad de ox geno atmosf rico y una fosforilaci n inicial. Por prueba se inoculan dos tubos de medio y uno de ellos se sella con aceite mineral o parafina para impedir la entrada de ox fermentaci n requiere de una fosforilaci n inicial, utiliza las v as de la Gluc lisis (Embden-Meyerhof-ParnasEMP), de las Pentosasfosfato y and LeifsonSustrato: as: Fermentativa y/u : Acido pir : Azul de bromotimol u otro indicador n/Fermentaci nLa oxidaci n de la glucosa produce cido pir vico por una v a de derivaci n (Shunt), ocurre en condiciones aerobias y no requiere de fosforilaci n n y oxidaci nVerdeAzul o verdeNingunoNi fermentaci n, ni oxidaci nAmarillo VerdeSelladoFermentaci nVerde (4)Amarillo (+)AbiertoOxidaci nTubo selladoTubo abiertoTubo con reacci n positivaReacci nLa producci n de cido se observa por el vire del indicador al amarillo.

5 En los tubos positivos puede haber generaci n de de Metilo/Voges ProskauerCaldo RM/VPSustrato: as: Fermentaci n cida o : Acido org nicos o aceto : Soluci n de Rojo de Metilo, Alfa Naftol y KOH 40%.Fermentaci n cido mixta: Los productos finales son cidos org nicos que provocan un descenso brusco del pH inicial del medio (viraje del indicador de amarillo pH por encima de 5,1) y rojo (pH por debajo de 4,4). Estos microorganismos por cada 4 mol culas de piruvato formadas, reducen dos a cido l ctico y dos las metabolizan para formar cido ac tico y f rmico; parte del acetato pasa a etanol y parte del f rmico a CO2y H2en cantidades de Metilo/Voges ProskauerFermentaci n butilenglic lica: en sta, parte del piruvato se metaboliza produciendo cantidades menores de cido l ctico, f rmico y ac tico, la mayor parte del piruvato se condensa formando acetilmetilcarbinol, que es reducido a 2,34butilenglicol, productos que son neutros.

6 Para determinar la presencia de los productos neutros ( prueba de Voges4 Proskauer): Se agrega un poco de 4naftol al 5% en etanol (medio adquiere aspecto lechoso), luego se le a ade (KOH 40%) que desaparece el aspecto lechoso, se agita fuertemente. ( prueba positiva color rosado 4 viol ceo en la parte superior del tubo; prueba negativa no tiene coloraci n).Utilizaci n de citratoPrueba negativa prueba positivaMedio de Citrato de SimmonsSustrato: Citrato de a: Varias dependientes del pH del : Acetato/formato en condiciones alcalinas y Acetato, CO2, lactato/Aceto na y CO2en condiciones : Azul de bromotimol. Un microorganismo que puede utilizar el citrato como nica fuente de carbono tambi n utiliza las sales de amonio del medio como nica fuente de nitr geno. La extracci n de nitr geno de las sales de amonio producen amoniaco y se alcaliniza el medio virando el indicador al Hierro de Kligler (KIA)Agar hierro de KliglerSustratos: Glucosa , lactosa 1% y Tiosulfato o grupos SH de la ciste na.

7 V a: Fermentativa y Enzimas: Tiosulfato reductasa y ciste na desulfurilasa4 Productos: cidos mixtos y : Rojo de fenol y sales de Fe2+.En presencia de tiosulfato en el medio o la degradaci n de prote nas liberando amino cidos azufrados, algunos microorganismos forman H2S gaseoso por medio de las enzimas tiosulfato reductasa y ciste na desulfurilasa. El gas incoloro H2S se forma en condiciones cidasy reacciona con el citrato de amonio f rrico para producir un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso met Hierro de Kligler (KIA)No fermentadoresPico de flauta alcalino y fondo alcalinoNo fermentadores de lactosaP ptidos Aminas O2 Glucosa cidos MixtosReacci n inicial: Pico de flauta cido y fondo cidoReacci n final: Pico de flauta alcalino y fondo cidoP ptidos Aminas O2 Glucosa cidos MixtosFermentadores de lactosaP ptidos Aminas O2 Glucosa + Lactosa cidos MixtosPico de flauta cido y fondo cidoP ptidos Aminas O2No fermentapH = Las bacterias incapaces de fermentar utilizan las peptonas y liberan aminas que alcalinizan todo el medio.

8 Las bacterias que solo fermentan la glucosa, inicialmente tambi n utilizan aer bicamente la glucosa. Debido a la baja concentraci n de glucosa ( ), metabolizan las peptonas alcalinizando la superficie del medio. Las bacterias fermentadoras de glucosa y lactosa, fermentan la glucosa y al t rmino de esta, fermentan la lactosa 1%, permitiendo la acidificaci n completa del Hierro de Kligler (KIA)4444C44441444+2+4++34+++44+++4A+Pro ducci n de H2S+Fermentaci n de Lactosa+Producci n de gas de la fermentaci n+Fermentaci n de Glucosa5 TuboEl medio de Kligler est dise ado para la identificaci n de enterobacterias y otras bacterias Gramnegativas. Interpretaci n:Medio SIM (Sulfh drico Indol Movilidad)Medio SIM (medio semis lido)Sustratos: Tiosulfato o grupos SH de la ciste na y tript fano. Enzimas: Tiosulfato reductasa, ciste na desulfurilasa y : H2S e : Sales de Fe2+y p4 Dimetilaminobenzaldeh do (DMABA).

9 prueba positiva prueba negativaEn presencia de tiosulfato en el medio o la degradaci n de prote nas liberando amino cidos azufrados, algunos microorganismos forman H2S gaseoso por medio de las enzimas tiosulfato reductasa y ciste na desulfurilasa. El gas incoloro H2S reacciona con el citrato de amonio f rrico para producir un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso met SIM (Sulfh drico Indol Movilidad)El medio de cultivo tiene consistencia semis lida por lo que la movilidad se observa por el crecimiento del microorganismo en todo el tubo, m s all de la zona de inoculaci n (picadura). Los microorganismos inm viles solo crecer n en la zona positiva prueba negativaPrueba negativa prueba positivaLas enzimas triptofanasas oxidan el tript fano para formar tres metabolitos: indol, metil indol y cido indolac tico. Los reactivos de Erhlich o Kovacs contienen DMABA que reacciona con el indol producido formado un compuesto quin nico color violeta, que se observa por la aparici n de un anillo en la superficie del urea o agar urea de : : : Amon : Rojo de hidr lisis de la urea por la enzima ureasa libera dos mol culas de amoniaco que alcaliniza el medio, entonces se vira el indicador de pH, en el caso del rojo de fenol una prueba positiva es color negativa prueba positivaReducci n de NitratosCaldo nitratos Sustrato: Nitrato de : Nitrato : : Reactivos de Griess.

10 N034 NO24 NO N2O N2 Nitrato reductasa (NAR). Nitrito reductasa (NIR). NO reductasa (NOR). N2O reductasa (N2OR).Reducci n de NitratosEl nitrito reacciona con dos reactivos: cido sulfan lico y dimetil4a4naftilamina(o a4naftilamina). La reacci n de color se debe a la formaci n de un compuesto diazonio, p4sulfobenceno4azo4 sulfan lico (incoloro)+ HNO2 Acido nitrosoAcido sulfan lico diazotizado (sal de diazonio)NSO3HN+ H2O + NH2 4naftilamina (incolora)p4sulfobenceno4azo4 4naftilamina (colorante rojo azo hidrosoluble)NH2+ H2O NSO3 HNAcoplamientoCuando la prueba resulta negativa para nitritos se utiliza la prueba del zinc para reducir qu micamente los nitratos presentes a nitritos y formar con los reactivos de Griess el compuesto amin acidos al perder el grupo carboxilo se convierten en diaminas lo que incrementa el pH del medio y el indicador (p rpura del bromocresol) vira a violeta.