TEMA 4. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA …

1 tema 4 . cromatograf A DE L QUIDOS DE ALTA RESOLUCI N CARACTER STICAS Y EQUIPOS DISPONIBLES Caracter sticas m s importantes Equipos disponibles en el departamento de Ingenier a Qu mica y en los Servicios T cnicos de investigaci n de la Universidad de Alicante INSTRUMENTACI N PARA cromatograf A DE L QUIDOS Recipientes para la fase m vil y sistemas para el tratamiento de los disolventes Sistemas de bombeo Tipos de bombas Amortiguadores de pulsos Control del caudal y sistemas de programaci n Sistemas de inyecci n de muestra Columnas para cromatograf a de l quidos Columnas anal ticas Precolumnas Termostatos Tipos de rellenos de la columna Detectores Detectores de absorbancia Detectores de fluorescencia Detectores de ndice de refracci n Detector de

2 Dispersi n de luz Detectores electroqu micos TIPOS DE cromatograf A HPLC cromatograf a de reparto Columnas para cromatograf a con fases unidas qu micamente Establecimiento del m todo en cromatograf a de reparto Aplicaciones de la cromatograf a de reparto cromatograf a de adsorci n Selecci n del disolvente en cromatograf a de adsorci n Aplicaciones de la cromatograf a de adsorci n cromatograf a i nica Equilibrios de intercambio i nico Rellenos de intercambio i nico Aplicaciones inorg nicas de la cromatograf a nica Aplicaciones org nicas y bioqu micas cromatograf a de exclusi n por tama os Rellenos de columna Aplicaciones de la cromatograf a de exclusi n por tama os 4. cromatograf a de l quidos de alta resoluci n CARACTERISTICAS Y EQUIPOS DISPONIBLES Caracter sticas m s importantes Aplicaciones principales: T cnica de separaci n para los materiales menos vol tiles e i nicos; an lisis cuantitativo de multicomponentes.

3 Fen meno molecular: Reparto entre una soluci n l quida y un substrato Ventajas en el an lisis cualitativo: Separa materiales para su examen por medio de otras t cnicas. Ventajas en el an lisis cuantitativo: Aplicaci n amplia a los materiales menos vol tiles, an lisis de multicomponentes. Muestra promedio deseable: 10 mg Limitaciones del m todo: Se tarda en desarrollar el m todo Limitaciones para la muestra: Ninguna Equipos disponibles en el departamento de Ingenier a Qu mica y en los Servicios T cnicos de Investigaci n de la Universidad de Alicante Dpto de Ingenier a Qu mica Tres cromat grafos Shimadzu. Detectores de absorbancia ultravioleta, de conductividad i nica y de ndices de refracci n. Termostatos para control de la temperatura de la columna. Servicios T cnicos de Investigaci n Tres cromat grafos (Shimadzu, Waters y Dionex) todos con posibilidades de gradientes de concentraci n de eluyente.

4 Detectores de absorci n ultravioleta, ndices de refracci n, fluorescencia, conductividad, serie de diodos (UV) y espectrometr a de masas. Termostatos para control de la temperatura de la columna. Un inyector autom tico de muestras. 4. cromatograf a de l quidos de alta resoluci n Este cap tulo trata de los cuatro tipos b sicos de cromatografia en los que la fase m vil es un l quido : (1) cromatograf a de reparto; (2) cromatograf a de adsorci n, o l quido -s lido; (3) cromatograf a i nica; y (4) cromatograf a de exclusi n por tama os, o en geles. Todo este cap tulo tiene relaci n con las aplicaciones en columna de estos cuatro importantes tipos de cromatografia. En una primera etapa la cromatografia de l quidos se realizaba en columnas de vidrio con di metros de 1 a 5 cm y longitudes de 50 a 500 cm. En este tipo de columnas realiz Tswett sus trabajos originales.

5 Para asegurar unos caudales razonables, el di metro de las part culas de la fase estacionaria s lida por lo general era de 150 a 200 m. Incluso as , los caudales eran bajos, llegando a unas pocas d cimas de mililitro por minuto. En consecuencia, los tiempos de separaci n eran largos -a menudo de varias horas-. Los intentos para acelerar el procedimiento cl sico mediante la aplicaci n de vac o, o por bombeo no resultaron efectivos, puesto que el aumento de caudal originaba un aumento de la altura de plato por encima del m nimo caracter stico que se observa en las gr ficas de la altura de plato frente al caudal y el resultado era una menor eficacia. En las primeras etapas del desarrollo de la cromatograf a de l quidos, los cient ficos se dieron cuenta de que se pod an conseguir grandes aumentos en la eficacia de la columna disminuyendo el tama o de las part culas de los rellenos.

6 Sin embargo, no fue sino hasta finales de los a os sesenta cuando se desarroll la tecnolog a adecuada para producir y utilizar rellenos de tama o de part cula del orden de los 3 o 10 m. Esta tecnolog a requiere una instrumentaci n sofisticada, que contrasta con las simples columnas de vidrio de la cromatograf a de l quidos cl sica. Para distinguir estos procedimientos m s nuevos de los m todos b sicos, que todav a se utilizan con fines preparativos, se emplea la denominaci n de cromatograf a de l quidos de alta resoluci n (HPLC). Es incuestionable que la cromatograf a de l quidos de alta resoluci n es la t cnica de separaci n m s ampliamente utilizada, con unas ventas anuales de equipos de HPLC que se aproximan a la cifra de cientos de miles de millones de pesetas. Las razones de la popularidad de esta t cnica son su sensibilidad, su f cil adaptaci n a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separaci n de especies no vol tiles o termol biles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial inter s en la industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general.

7 Algunos ejemplos de estos materiales incluyen los amino cidos, prote nas, cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, drogas, terpenoides, plaguicidas, antibi ticos esteroides, especies organomet licas y una cierta variedad de sustancias inorg nicas. La Figura pone de manifiesto que los distintos procedimientos que utilizan la cromatograf a de l quidos tienden a ser complementarios por lo que a sus campos de aplicaci n se refiere. As , para solutos con masas moleculares superiores a 10 000, a menudo se utiliza la cromatograf a de exclusi n, aunque ahora tambi n es posible tratar estos compuestos con cromatografia de reparto en fase inversa. Para especies i nicas de baja masa molecular, se utiliza con frecuencia la cromatografia de intercambio i nico. Los m todos de reparto se aplican a las especies poco polares pero no i nicas. Adem s, este procedimiento se utiliza muchas veces para la separaci n de los integrantes de una serie hom loga.

8 La cromatografia de adsorci n se elige con frecuencia para separar compuestos como, por ejemplo, los hidrocarburos alif ticos de los alcoholes alif ticos. 4. cromatograf a de l quidos de alta resoluci n Figura Aplicaciones de la cromatograf a de l quidos Por otro lado, la discusi n sobre el ensanchamiento de banda del tema 2 es aplicable a la cromatografia de l quidos. A continuaci n se ilustra el importante efecto del tama o de part cula del relleno y se describen otras dos causas del ensanchamiento de zona, que a veces son de notable importancia en cromatografia de l quidos, Efectos del tama o de part cula del relleno. El coeficiente de transferencia de masa de la fase m vil es funci n inversa del cuadrado del di metro de las part culas que constituyen el relleno. Como consecuencia de ello, la eficacia de una columna de HPLC deber a mejorar espectacularmente cuando disminuye el tama o de part cula.

9 Por ejemplo una reducci n del tama o de part cula de 45 a 6 m origina una disminuci n de diez o m s veces de la altura de plato. Ensanchamiento de banda extracolumna en cromatograf a de l quidos. En cromatografia de l quidos, tiene lugar a veces un ensanchamiento de banda significativo fuera del relleno de la columna. Este ensanchamiento, denominado ensanchamiento de banda extracolumna, tiene lugar cuando se transporta el soluto a trav s de tubos como los que se utilizan en los sistemas de inyecci n, en los detectores y en los tubos que conectan los distintos componentes del sistema. El ensanchamiento proviene de la dife-rente velocidad de flujo que hay entre las capas de l quido adyacentes a las paredes del tubo y las del centro. Como consecuencia, la parte central de una banda de soluto se mueve con m s rapidez que la periferia. En cromatografia de gases la difusi n compensa la dispersi n extracolumna.

10 Sin embargo, la difusi n en los l quidos es signi-ficativamente menor, y con frecuencia este tipo de ensanchamiento de banda se hace evidente. 4. cromatograf a de l quidos de alta resoluci n Cuando se utilizan columnas de peque o di metro, el ensanchamiento extracolumna puede hacerse bastante importante. En este caso, todos los esfuerzos han de orientarse a la reducci n del radio de los tubos del sistema externos a la columna. Efecto del tama o de muestra en la eficacia de la columna. La cantidad de muestra ( g de muestra/g de relleno) tambi n afecta a la eficacia de la columna. Para las aplicaciones con columnas de reparto y adsorci n, la eficacia decrece notablemente con la cantidad de muestra. En columnas de fase inversa el decrecimiento en eficacia es mucho mas peque o. INSTRUMENTACI N PARA cromatograf A DE L QUIDOS Con objeto de alcanzar un caudal de eluyente razonable con rellenos de tama o de part cula entre 3 y 10 m, que, por otra parte, son comunes en la moderna cromatografia de l quidos, se requieren presiones de algunos cientos de kilos por cent metro cuadrado.