Artículo de investigación Caracterización de cepas de ...

1 Rev. Colomb. Cienc. Qu m. Farm. Vol. 38 (1), 78-104, 2009 Art culo de investigaci n Caracterizaci n de cepas de rhizobium y Bradyrhizobium (con habilidad de nodulaci n) seleccionados de los cultivos de fr jol caupi (Vigna unguiculata) como potenciales bioin culos Bernarda Cuadrado*, Guillermo Rubio, Winston Santos Grupo de Investigaci n en Microbiolog a y Sistemas Simbi ticos, Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias Qu micas y Farmac uticas, Universidad de Cartagena. * Correo electr nico: Recibido para evaluaci n: febrero 27 de 2009. Aceptado para publicaci n: mayo 18 de 2009. Resumen Los suelos de Latinoam rica son cidos y deficientes en nitr geno; por esta raz n es necesario explorar nuevas alternativas con el fin de modular el desarrollo de plantas, especialmente las leguminosas. El uso del potencial de las bacterias para inducir nodulaci n y fijar el nitr geno en las plantas leguminosas se ha estudiado como una opci n con potencial impacto.

2 En este estudio se analiz la diversidad de cepas de rhizobios aislados del fr jol Vigna unguiculata (fr jol caup ) cultivado en el norte del departamento de Bol var (Colombia). Se identificaron aislados capaces de crecer mejor en ambientes hostiles (los cuales tienen un uso potencial como bioinocu- lantes). Se describe adem s un acercamiento a la taxonom a de estas bioespecies. Se caracterizaron 52 cepas de rizobios (basados en sus caracter sticas morfol gicas, requerimientos de cultivo, metab licas, resistencia a metales y antibi ticos y de auten- ticaci n). De acuerdo con sus propiedades de crecimiento, el 63,5% fueron de cepas de lento, mientras que el 36,5%, de r pido crecimiento. Prevalecieron las de lento crecimiento con un 63,5% del total sobre un 36,5% de r pido crecimiento. Los aislados fueron caracterizados de acuerdo con sus patrones de asimilaci n de carbo- hidratos, y se encontraron microorganismos de los g neros rhizobium , Bradyrhizo- bium y Mesorhizobium (12 cepas identificadas como potenciales bioinoculantes).

3 Palabras clave: rhizobium , Bradyrhizobium, Vigna unguiculata, biodiversidad, bioi- n culos. 78. cepas de rhizobium y Bradyrhizobium como potenciales bioin culos Summary Characterization of rhizobium and Bradyrhizobiu s strains (with ability of nodulation) selected from bean (Vigna unguiculata). cultures as a potentials bioinoculants Latin America s soils are acidic and nitrogen-deficient, for this reason is neces- sary to explore new alternatives in order to modulate in the development of plants, specially the leguminous plants. The use of bacteria s potential to induce nodula- tion and to fix nitrogen in leguminous plants has been studied as an option with potential impact. In our study, we analyzed the diversity of rhizobial isolated of the bean Vigna unguiculata (beans cowpea) cultured in the north of Bolivar department (Colombia). We identified strains able of growing in hostile environment (which have a potential use like bioinoculants).

4 Additionally, we described an approach to taxonomy of these biospecies. We reached the characterization of 52 rhizobial strains (based on their morphologic, requires of culture, metabolic, resistance to metals and antibiotics and authentica- tion characteristics). According with their growing properties, % were slow growth strains while the % were of rapid growth. The isolates were characte- rized according to their assimilation carbohydrate s pattern, finding microorganism as rhizobium , Bradyrhizobium and Mesorhizobium (12 of which were identified as potential bioinoculants). Key words: rhizobium , Bradyrhizobium, Vigna unguiculata, biodiversity, bioinocu- lants. Introducci n El nitr geno se encuentra en la naturaleza fundamentalmente como gas (79% de la atm sfera), pero a pesar de su gran abundancia, de poco les sirve a las plantas y animales mientras permanezca en la atm sfera, ya que son incapaces de fijarlo y aprovecharlo.

5 Por fortuna, existen microorganismos que s son capaces de fijar ese nitr geno atmosf - rico y transformarlo en compuestos f cilmente asimilables (1). El grupo de bacterias al que se conoce colectivamente como rizobios inducen en las ra ces (o en el tallo) de las leguminosas la formaci n de estructuras especializadas, los n dulos, dentro de los cuales el nitr geno gaseoso se reduce a amonio. Se estima que 79. Cuadrado et al. este proceso contribuye entre el 60-80% de la fijaci n biol gica de nitr geno, o fbn, y esta simbiosis aporta una parte considerable del nitr geno combinado en la tierra y permite a las plantas leguminosas crecer sin fertilizantes nitrogenados y sin empobrecer los suelos. El uso indiscriminado de fertilizantes nitrogenados en agricultura ha ocasionando gra- ves problemas de contaminaci n. No todo el fertilizante que se aplica es aprovechado por la planta, sino que una cuant a importante acaba en lagos y lagunas.

6 La fbn es la opci n natural de fertilizaci n qu mica. Es marcado el inter s que estas bacterias representan para la agricultura, que se emplean como inoculantes (biofertilizantes). Ejemplo de ello es el rhizobium , que fue la pri- mera bacteria producida a gran escala y se ha a adido como inoculante durante 105. a os a diversos cultivos agr colas, con xito en muchos casos. La carencia de equipos y tecnolog as adecuadas para caracterizar y clasificar a los rizo- bios limitaron enormemente a los cient ficos en pocas pasadas; no obstante, parte de la informaci n que se tiene acerca del fenotipo y genotipo de los rizobios descansa en los resultados de las investigaciones llevadas a cabo hace m s de 60 a os (2). En la actualidad, la taxonom a de los rizobios se basa en un enfoque polif sico que incluye caracterizaci n de la morfolog a, bioqu mica, fisiolog a, gen tica y filogenia, entre otros aspectos, y no se pueden adelantar estudios de tipo gen tico si no se han identificado sus propiedades fenot picas (3).

7 Se estima que los rizobios no conocidos en el mundo representan un recurso biol gico porque las leguminosas son uno de los grupos de plantas m s grande y diverso y se encuentran distribuidas en distintos eco- sistemas (4). En la descripci n del fenotipo de estas bacterias se reportan caracter sticas morfol gicas y de colonias, bioqu micas, fisiol gicas, patrones de utilizaci n de fuentes de carbono y nitr geno y resistencia a antibi ticos, entre otras. Estos datos se eval an normalmente por un an lisis de agrupamiento, la taxonom a num rica, lo cual puede ofrecer una visi n detallada de la variaci n de las bacterias dentro de una especie o entre diferentes especies y reconocer rasgos caracter sticos de cada especie (5). Algunos rizobios tienen un rango m s amplio de plantas hu spedes que otras y hay muchos problemas con este acercamiento, incluso el hecho de que existen cerca de especies de legumbres e incontables tipos de rizobios.

8 La especificidad del anfi- tri n de las bacterias y plantas pr cticamente ha desaparecido, y un ejemplo es el caso particular de los rizobios aislados de Vigna (V.) unguiculata, en que la mayor a es capaz de nodular a todas las legumbres (6). 80. cepas de rhizobium y Bradyrhizobium como potenciales bioin culos Son varias las especies de leguminosas comestibles que se siembran en Colombia; el rea que ocupan se concentra principalmente en la Regi n Andina y valles interandi- nos. Colombia es el primer pa s productor de fr jol en la Zona Andina, con alrededor de hect reas sembradas en 2007 y donde el primer lugar lo ocupa el fr jol com n (Phaseolus vulgaris), con hect reas, mientras que en la Regi n Caribe, la importancia la tiene el fr jol caupi (Vigna sp), con hect reas (7,8). Entre tanto, en el pa s se tiene que importar fr jol, pues la demanda es m s alta que la oferta, por lo que se est incentivando la siembra de esa leguminosa (9).

9 Los suelos de Latinoam rica se caracterizan por ser deficientes en nitr geno y tener, en t rminos generales, niveles bajos de f sforo y un pH cido, lo cual, adem s de ser facto- res limitantes de la productividad de las plantas, afectar an el desarrollo de la simbiosis leguminosa- rhizobium (10). En vista de esto, los cient ficos vislumbran la soluci n en el mejoramiento genot pico de las plantas y el fomento de microorganismos que favo- rezcan la eficiente utilizaci n de nitr geno y otros nutrientes. En 1987, Rodr guez y Cerrato aislaron 120 cepas de rhizobium (R.) phaseoli en los estados de M xico, Tlaxcala, Hidalgo y Puebla. stas se caracterizaron por su morfo- log a macro- y microsc pica, adem s de sus propiedades bioqu micas. Los resultados que obtuvieron permitieron agrupar varias cepas con propiedades fisiol gicas que se pusieron de manifiesto en invernadero y en campo (11). En el verano de 1996, Gonz lez caracteriz y calcul mediante dendograma los ndi- ces de similitud entre diferentes cepas de la familia Rhizobiaceae aisladas de plantas de caupi (V.)

10 Unguiculata) en el departamento de C rdoba (Colombia). Tambi n caracte- riz la cepa ciat 4645, utilizada como control positivo del procedimiento. La perte- nencia de las cepas a la familia Rhizobiaceae se comprob amplificando por medio de la t cnica de Reacci n de la Polimerasa (pcr) un fragmento del gen nif-H; se encontr . que de las 11 cepas aisladas analizadas, ocho de ellas y la cepa ciat 4645 amplificaron un fragmento de 789 pb correspondientes al gen nif-H, lo cual comprueba la alta varia- bilidad existente dentro de las cepas aisladas de plantas de caup de un mismo cultivo y confirma la promiscuidad de V. unguiculata, pues se observa que una misma planta se encuentra inoculada por cepas diferentes en n dulos distintos (12). En 2000, Diouf y colaboradores obtuvieron 58 nuevas cepas aisladas de n dulos de ra - ces de fr jol com n cultivado en suelos originarios de diferentes reas agroecol gicas en Senegal y Gambia (este de frica).