Fosfatasa Acida - Wiener lab.

1 860202200 / 00 p. 1/6M todo cin tico para la determinaci n de fosfatasas cida total y prost ticaFosfatasa Acida Total y Prost tica cin ticaSIGNIFICACION CLINICALas fosfatasas cidas se encuentran presentes en casi to-dos los tejidos del organismo, siendo particularmente altas las cantidades de estas enzimas en pr stata, est mago, h gado, m sculo, bazo, eritrocitos y plaquetas. Las distintas isoenzimas se diferencian entre s por su pH ptimo, peso molecular, y requerimientos de activadores e Fosfatasa cida prost tica (PAP) constituye un valioso auxiliar en el diagn stico precoz de c ncer prost tico, una de las formas neopl sicas de mayor morbilidad.

2 La determinaci n de la actividad enzim tica de PAP usando -naftil fosfato como sustrato ha mostrado sensibilidad y especificidad adecuadas para su utilizaci n en el diagn stico de esta encuentran actividades elevadas de Fosfatasa cida total (ACP) en algunas enfermedades hematol gicas (leucemia mieloc tica, trombocitopenia idiop tica) y seas (enfermedad de Paget, carcinoma seo), as como en algunos tipos de c ncer, enfermedades hep ticas (hepatitis, ictericia obstructiva), DEL METODOLa Fosfatasa cida (ACP EC ) hidroliza el -naftil fosfato a pH 5,2 con liberaci n de fosfato y -naftol.

3 El naf-tol reacciona a su vez con un diazorreactivo presente en el sistema (Fast Red TR) produciendo un pigmento amarillo, de modo que el aumento de la absorbancia, le do a 405 nm, es proporcional a la actividad de Fosfatasa cida total (ACP) de la muestra. Cuando se mide la actividad en presencia de tartrato, se inhibe la actividad de la isoenzima prost tica. La diferencia entre las actividades de Fosfatasa cida total (ACP) y de la resistente al tartrato ( Fosfatasa Acida no Prost tica/ACP-NP) corresponde a la fracci n prost tica (PAP).REACTIVOS PROVISTOSA. Reactivo A: buffer citrato 0,1 mol/l, pH 5, Reactivo B: viales conteniendo -naftil fosfato 10 mmol/l y Fast Red TR 1,5 Reactivo C: soluci n de tartrato 135 mmol/l en buffer citrato 100 mmol/l, pH 5, Reactivo D: soluci n de cido ac tico 0,7 NO PROVISTOSS oluci n fisiol gica (cloruro de sodio 9 g/l).

4 INSTRUCCIONES PARA SU USOF osfatasa Acida Total (FAT/ACP)Reactivo B; preparaci n: disolver con el volumen de Reac-tivo A indicado en el r tulo. Marcar en el r tulo Acida no Prost tica (FANP/ACP-NP)Reactivo B; preparaci n: disolver con el volumen de Reac-tivo C indicado en el r tulo. Marcar en el r tulo reactivos son para uso diagn stico "in vitro".Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de an lisis cl los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a la normativa local E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTOR eactivos Provistos: son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.

5 La expo-sici n prolongada a temperatura ambiente puede deteriorar el Reactivo B reconstituido: estable 3 d as refrigerado (2-10oC) o 24 horas a temperatura ambiente (< 25oC).INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOSC uando las lecturas a 405 nm, del Reactivo B reconstituido, son mayores a 0,250 , llevando el aparato a cero con agua, son indicio de deterioro del ) Recolecci n: obtener suero de la manuera usual. No utilizar plasma. La Fosfatasa cida prost tica es sumamente inestable in vitro y al pH del suero a temperatura ambiente puede perderse hasta un 50% de actividad en pocas horas.

6 Por lo tanto debe separarse el suero del co gulo dentro de una hora de la extracci n, conserv ndolo refrigerado (2-10oC) hasta el momento de ) Aditivos: para evitar la inactivaci n durante el almace-namiento puede acidificarse la muestra agregando 50 ul de Reactivo D (ac tico 0,7 mol/l) por cada ml de suero. c) Sustancias interferentes conocidas:- Sueros con marcada ictericia muestran baja recuperaci n de la actividad enzim tica por lo que su uso debe No se observa interferencia por lipemia hasta 600 mg/dl de triglic ridos, ni hemoglobina hasta 100 mg/dl.

7 - Los anticoagulantes interfieren en la reacci n por lo que no debe emplearse plasma en la determinaci a la bibliograf a de Young para los efectos de las drogas en el presente m ) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: si C860202200 / 00 p. 2/6se emplea el conservador descripto en b) la muestra puede conservarse refrigerada (2-10oC) durante varios d as sin p rdida significativa de la actividad. De lo contrario, proceder como se describe en a).MATERIAL REQUERIDO (no provisto)- Espectrofot Micropipetas y pipetas para medir los vol menes Cubetas espectrofotom tricas de caras Cron DE REACCION- Longitud de onda: 405 nm- Temperatura de reacci n: 37oC- Tiempo de reacci n: 3 minutosPROCEDIMIENTOEn una cubeta mantenida a 37oC colocar: ACP ACP-NPReactivo B ACP 1 ml -Reactivo B ACP-NP - 1 mlPreincubar unos minutos.

8 Luego agregar:Muestra 100 ul 100 ulACP: mezclar y disparar simult neamente el cron metro. A los 5 minutos registrar la Leer posteriormente la absorbancia cada minuto durante 3 minutos. Determinar la diferencia promedio de absorbancia/minuto ( A/min) restando cada lectura de la anterior y promediando los valores. Utilizar este promedio para los c lculos ( A1/min). ACP-NP: proceder de la misma manera que para ACP. Se obtiene el A2 DE LOS RESULTADOSF osfatasa Acida Total (ACP) = A1/min x 743 = (U/l1) Fosfatasa Acida no Prost tica (ACP-NP) = A2/min x 743 = (U/l2) Fosfatasa Acida Prost tica (PAP) (U/l) = U/l1 - U/l2 VALORES DE REFERENCIAF osfatasa Acida Total (ACP): < 9 U/l (a 37oC) Fosfatasa Acida Prost tica (PAP): < 3,5 U/l (a 37oC)La actividad de ACP es muy escasa en el hombre sano y casi nula en la mujer, de modo que los valores esperados se encuentran en el l mite del error instrumental o muy cercanos al l mite de detecci n del sistema.

9 No obstante se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de DEL PROCEDIMIENTO- Ver Sustancias interferentes conocidas en Las enzimas son sensibles a la acci n de ciertos contami-nantes y venenos enzim ticos (metales pesados, cianuros, tensioactivos, etc.) por lo que se recomienda extremar las precauciones en la limpieza del material empleado en la extracci n de muestras y en la determinaci Alteraciones iatrog nicas: existen algunos medicamentos que pueden afectar los valores plasm ticos de PAP, as como el masaje, cateterismo y otras manipulaciones pros-t ticas por lo que es conveniente interrogar al paciente o al m dico tratante sobre toda medicaci n, tratamiento o procedimiento diagn stico a que est sujeto el El diagn stico cl nico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de un nico ensayo, sino que debe integrar los datos cl nicos y de DE CONTROL DE CALIDADP rocesar con cada determinaci n.

10 Dos niveles de un material de control de calidad (Standatrol S-E 2 niveles) con acti-vidades conocidas de fosfatasas cida total y prost ) Reproducibilidad: se aplic el protocolo EP15A del CLSI. Se analizaron dos niveles de actividad, cada uno por cua-druplicado durante 5 d as, en analizador autom tico. Con los datos obtenidos, se calcul la precisi n intraensayo y Acida TotalPrecisi n Intraensayo Nivel 23,7 U/l U/l 1,7 % 45,2 U/l 0,575 U/l 1,3 %Precisi n Total Nivel 23,7 U/l 0,480 U/l 2,0 % 45,2 U/l 0,872 U/l 1,9 % Fosfatasa Acida No Prost ticaPrecisi n Intraensayo Nivel 11,6 U/l 0,307 U/l 2,7 % 24,5 U/l 0,718 U/l 2,9 %Precisi n Total Nivel 11,6 U/l 0,351 U/l 3,0 % 24,5 U/l 0,776 U/l 3,2 %b) Linealidad: la reacci n es lineal hasta 74 U/l ( A/min = 0,100 ).