INTRODUCCIÓN AL CULTIVO CELULAR

1 INTRODUCCI N AL CULTIVO CELULAR El CULTIVO de tejidos ha sido considerado durante mucho tiempo como una mezcla de ciencia y arte. Inicialmente fue considerada como una t cnica particularmente dif cil de aprender. Sin embargo, hoy en d a estas dificultades est n superadas gracias a factores como los medios de composici n definida, la disponibilidad de antibi ticos, las instalaciones as pticas (salas de CULTIVO limpias, cabinas de flujo laminar, incubadores est riles, etc), dispositivos de CULTIVO (botellas con tapones filtrantes, placas de Petri ventiladas, etc). Introducci n hist rica El CULTIVO de tejidos se desarroll a partir de los ltimos a os del siglo XIX como una continuaci n de las t cnicas de la embriolog a. En el a o 1885, Wilhem Roux mantuvo c lulas de embri n de pollo en soluci n salina durante unos d as. Se considera al zo logo americano R. G. Harrison como el iniciador de los cultivos de tejidos animales.

2 En 1907, Harrison fue el primer cient fico que emple t cnicas in vitro para el estudio de fen menos in vivo, realizando cultivos de m dula espinal embrionaria de anfibios. Pudo observar el crecimiento de los axones de los neuroblastos, y estableci que el ax n se formaba por expansi n a partir del cuerpo neuronal y no por fusi n de una cadena de c lulas. El CULTIVO se realizaba en una gota de linfa del anfibio que colgaba de un cubreobjetos sobre una c mara sellada. La primera limitaci n para el establecimiento de cultivos era lograr un medio nutritivo adecuado. Burrows (1910) emple plasma de pollo para nutrir los explantes de tejidos embrionarios de pollo. Este medio se revel mucho mejor que los anteriormente probados, lo que le permiti observar el crecimiento del tejido nervioso, coraz n y piel. Burrows y Carrel demostraron que la vida del CULTIVO se puede prolongar mediante subcultivos.

3 Los medios empleados fueron plasma suplementado con extractos de embri n. Rous y Jones (1916) emplearon por vez primera extractos enriquecidos en tripsina para disociar las c lulas de embriones de pollo, estableciendo el primer CULTIVO CELULAR . Uno de los mayores problemas que describen para el establecimiento de los cultivos celulares es la aparici n de m ltiples contaminaciones, por lo que desarrollaron numerosos m todos de manipulaci n en condiciones de asepsia que a n hoy d a se utilizan. En 1913 Carrel demostr la posibilidad de mantener en CULTIVO c lulas extra das de un animal, embri n de pollo, durante un periodo de tiempo superior al de la vida de ste. Mantuvo en CULTIVO c lulas de pollo durante 34 a os. Gran parte del xito en el mantenimiento de los cultivos se debi al desarrollo del denominado frasco de Carrel. Entre los a os 1920 y 1940 se desarrollaron diferentes estrategias de obtenci n de cultivos y de mantenimiento de las condiciones est riles, pero sin grandes avances.

4 A partir de los a os 40, con el aislamiento de los primeros antibi ticos, se desarrollaron numerosas aplicaciones. En 1948, Earle y col. aislaron c lulas de la l nea CELULAR L y mostraron que eran capaces de formar clones en el CULTIVO de tejidos. Demostraron que para que una c lula llegue a dividirse necesita ser alimentada con los nutrientes correctos. En 1952, Gry y col. establecen la primera l nea CELULAR humana, las c lulas HeLa. El medio empleado era extremadamente complejo y poco definido: plasma de pollo, extracto de embri n bovino y suero de cord n umbilical humano. En 1954, Rita Levi-Montalcini y col. establecen que el factor de crecimiento nervioso estimula el crecimiento de los axones en tejidos en CULTIVO . Este trabajo supuso el Premio Nobel para Levi-Montalcini en 1986. En 1955, Eagle realiza la primera investigaci n sistem tica de los requerimientos nutritivos de las c lulas en CULTIVO .

5 En 1961, Hayflick y Moorhead establecieron que la duraci n de los cultivos de fibroblastos era finita: pod an mantener estos cultivos durante 12 pases. No consiguieron establecer l neas estables. En 1965, Ham introduce el primer medio definido libre de suero capaz de mantener algunas c lulas de mam fero en CULTIVO indefinidamente. En 1969, Augusti-Tocco y Sato establecen la primera l nea CELULAR estable de neuroblastoma aislando clones que establec an procesos nerviosos y que eran el ctricamente excitables. Se empiezan a establecer las primeras l neas celulares diferenciadas. En 1975, Kohler y Milstein establecen la primera l nea CELULAR productora de anticuerpos monoclonales. El establecimiento de la tecnolog a de obtenci n de anticuerpos monoclonales les vali el Premio Nobel. En la d cada de 1980 se empiezan a conocer los mecanismos de la transformaci n.

6 En la d cada de 1990 empezaron a producirse medicamentos a escala industrial en biorreactores. Se desarrolla la biotecnolog a. En 1998 se produce cart lago mediante ingenier a de tejidos y en 2003 se experimenta el auge de esta nueva disciplina. En 2007 se reprograman c lulas adultas para convertirlas en c lulas pluripotenciales inducidas. Tipos de CULTIVO CELULAR Actualmente se entiende por CULTIVO CELULAR al conjunto de t cnicas que permiten el mantenimiento de las c lulas 'in vitro', manteniendo al m ximo sus propiedades fisiol gicas, bioqu micas y gen ticas. Se distinguen cuatro tipos de CULTIVO CELULAR . CULTIVO de rganos Se coloca el rgano sobre una rejilla situada en la interfase l quido-gas de un medio del que obtiene los nutrientes y al que puede liberar los desechos. Este tipo de CULTIVO permite mantener, al menos en parte, la arquitectura caracter stica del tejido in vivo.

7 Se conservan las interacciones histol gicas y, gracias a ello, este tipo de CULTIVO permite mantener los tipos celulares diferenciados, por lo que representan una buena r plica del tejido de origen. Sin embargo, no crecen mucho (la proliferaci n CELULAR se limita a las c lulas embrionarias de la periferia) y no se pueden propagar. Se necesita un nuevo explante para cada experimento lo que supone mucho m s trabajo y una limitada reproducibilidad de la muestra. Cuantificar es dif cil y la cantidad de material que se puede cultivar es reducida. Explantes primarios Se coloca un fragmento de tejido o de rgano en la interfase s lido-l quido de un soporte de vidrio o de pl stico. Las c lulas se adhieren a la superficie y las c lulas de la periferia del explante pueden migrar y proliferar por la superficie del soporte. CULTIVO CELULAR primario Es el tipo de CULTIVO m s utilizado. Se puede obtener a partir de explantes primarios o de suspensiones de c lulas disgregadas.

8 La disgregaci n CELULAR se realiza por m todos enzim ticos o mec nicos. En estos cultivos se pierden las interacciones c lula-c lula y las interacciones de la c lula con la matriz extracelular. Sin embargo, las c lulas son capaces de proliferar y la poblaci n CELULAR crece notablemente. Cuando las c lulas ocupan toda la superficie disponible se dice que han alcanzado la confluencia. En esta etapa, las c lulas establecen contactos entre ellas que inhiben su proliferaci n y el crecimiento se detiene. Por eso, al cabo de un tiempo hay que transplantar las c lulas a un nuevo soporte. Esta operaci n se denomina subcultivo o pase. Existen dos tipos de CULTIVO CELULAR primario: cultivos en monocapa: las c lulas crecen adheridas sobre un soporte s lido (pl stico o vidrio). El anclaje al sustrato es un prerrequisito para la proliferaci n CELULAR . Es el m todo utilizado para la mayor a de las c lulas excepto para las hematopoy ticas.

9 cultivos en suspensi n: las c lulas se encuentran dispersas en el medio de CULTIVO . Su crecimiento no depende del anclaje. Este tipo de CULTIVO se restringe a las c lulas hematopoy ticas, c lulas madre, l neas celulares transformadas y c lulas tumorales. Alcanzan la confluencia cuando el n mero de c lulas es grande y los nutrientes son insuficientes. Subcultivos y l neas celulares Las c lulas del CULTIVO primario en monocapa se dispersan por m todos enzim ticos y se pasan a un nuevo frasco de CULTIVO . En el caso de c lulas en suspensi n, sencillamente se diluyen en medio fresco. Los sucesivos cultivos as formados se denominan una l nea CELULAR . La formaci n de una l nea CELULAR a partir de un CULTIVO primario implica que: aumenta el n mero de c lulas obtenidas acaban predominando uno o dos tipos celulares: los que tienen mayor tasa de crecimiento la poblaci n CELULAR se hace uniforme y homog nea sus caracter sticas se conservan durante las sucesivas generaciones y, si se conservan en nitr geno l quido, de forma indefinida Normalmente, las l neas celulares tienen una vida finita que, seg n el tipo de c lula, se puede prolongar entre 20 y 100 generaciones.

10 Superado ese l mite, las c lulas entran en una etapa que se denomina senescencia en la que pierden su capacidad de proliferar (supuestamente por el acortamiento de los tel meros) y mueren. Sin embargo, algunas c lulas (como las de roedores y las tumorales) evitan la senescencia y dan lugar a l neas celulares continuas, que crecen indefinidamente. Estas c lulas pueden surgir de forma espont nea (exposici n a radiaciones ionizantes o a carcin genos qu micos) o inducida (infecci n v rica o transfecci n de ADN) y son el resultado de un cambio genot pico denominado transformaci n. Las c lulas transformadas se caracterizan porque: Son inmortales: crecen indefinidamente Su crecimiento es aberrante: se pierde la inhibici n por contacto, la limitaci n de la densidad CELULAR durante la proliferaci n y la dependencia del anclaje Son malignas: invaden tejidos y dan lugar al crecimiento de tumores Son gen ticamente inestables: son heteroploides (var a el n mero de cromosomas) y presentan aberraciones cromos micas En 1952 se obtuvo la primera l nea CELULAR continua humana.