Pruebas Bioquímicas - UNAM

1 Pruebas bioqu micasDeterminan la actividad metab lica de una cepa pura. Son empleadas principalmente la identificaci n y clasificaci n de bacterias y hongos. Pruebas bioqu micasSe pueden resumir en los siguientes puntos: Sustrato (contenido en el medio de cultivo) Enzima o v a metab lica (secretada o en el interior del microorganismo) Producto Revelador y/o indicador (aunque algunas no los emplean)E + S ES E + PE + S E + S ES ES E + PE + PLos fundamentos completos de estas Pruebas y dem s informaci n pueden encontrarlos en el libro: Pruebas bioqu micas para la identificaci n de bacterias de importancia cl nicade Jean F.

2 MacFaddin, Editorial M dica lisis del Almid nAgar Almid n Sustrato: Almid n (pol mero de glucosa).Enzima: Amilasa (exoenzima).Producto: : Lugol. El lugol con el almid n forman un complejo color caf 4p rpura que desaparece cuando el almid n ha sido almid n es producido principalmente por plantas superiores, est compuesto de amilosa y amilopectina. Diversas enzimas amilol ticashidrolizan almid n y sus negativa prueba positivaDegradaci n de la case naPrueba negativa prueba positivaAgar Leche DescremadaSustrato: Case na (prote na).

3 Enzima: Caseinasa (Proteasa, exoenzima).Producto: Amino : No requiere. Las proteasas son excretadas al medio para la degradaci n de prote nas, la case na es la prote na de la leche que le confiere el color blanco, cuando la case na es hidrolizada desaparece el color blanco alrededor del crecimiento lisis de la lecitina y reducci n del teluritoAlgunos microorganismos producen lecitinasa que hidroliza la lecitina (fosfol pido). Se utiliza el agar yema de huevo. Las colonias productoras de lecitinasa forman una zona opaca a su medio de Baird Parker es empleado para el aislamiento y cuantificaci n de estafilococos cuagulasa positivos, al que se adicionan componentes que lo hacen selectivo.

4 Las colonias t picas de S. aureusson oscuras por la reducci n del telurito, adem s presentan el halo de hidr lisis de la yema de huevo/Agar Baird ParkerSustrato: : : : No n de la gelatinaGelatina NutritivaSustrato: Gelatina (prote na).Enzima: Gelatinasa (Proteasa, exoenzima).Producto: Amino : No requiere o puede emplearse el carb n activado en polvo. La gelatina es una prote na que tiene la capacidad de gelificar, cuando es hidrolizada por la gelatinasa en los amino cidos que la componen pierde su caracter stica de gelificar.

5 Se pueden emplear varios medios que permiten la visualizaci n macrosc pica como la gelatina adherida a carb n negativa prueba positivaFermentaci n de carbohidratosMedio base rojo de fenol m s carbohidrato o polialcohol, con campana de fermentaci n (Durham).Sustrato: Carbohidrato o a: : cidos org : Cualquier indicador de compuestos de carbono (carbohidratos o polialcoholes) deben ser incorporados, algunos requieren de ser degradados en mon meros y transportados a la c lula para posteriormente en condiciones anaerobias ser metabolizados por la v a fermentativa.

6 La fermentaci n (degradaci n) de un compuesto org nico se observa por la acidez en el medio de cultivo y la formaci n de gas capturado en la campana de fermentaci (A)/Positivo(AG)Oxidaci n/Fermentaci nLas bacterias utilizan hidratos de carbono por uno de dos procesos metab licos, fermentativo u oxidativo. La principal diferencia es la necesidad de ox geno atmosf rico y una fosforilaci n inicial. Por prueba se inoculan dos tubos de medio y uno de ellos se sella con aceite mineral o parafina para impedir la entrada de ox fermentaci n requiere de una fosforilaci n inicial, utiliza las v as de la Gluc lisis (Embden-Meyerhof-ParnasEMP), de las Pentosasfosfato y and LeifsonSustrato: as: Fermentativa y/u : Acido pir.

7 Azul de bromotimol u otro indicador n/Fermentaci nLa oxidaci n de la glucosa produce cido pir vico por una v a de derivaci n (Shunt), ocurre en condiciones aerobias y no requiere de fosforilaci n n y oxidaci nVerdeAzul o verdeNingunoNi fermentaci n, ni oxidaci nAmarillo VerdeSelladoFermentaci nVerde (4)Amarillo (+)AbiertoOxidaci nTubo selladoTubo abiertoTubo con reacci n positivaReacci nLa producci n de cido se observa por el vire del indicador al amarillo. En los tubos positivos puede haber generaci n de de Metilo/Voges ProskauerCaldo RM/VPSustrato: as: Fermentaci n cida o : Acido org nicos o aceto : Soluci n de Rojo de Metilo, Alfa Naftol y KOH 40%.

8 Fermentaci n cido mixta: Los productos finales son cidos org nicos que provocan un descenso brusco del pH inicial del medio (viraje del indicador de amarillo pH por encima de 5,1) y rojo (pH por debajo de 4,4). Estos microorganismos por cada 4 mol culas de piruvato formadas, reducen dos a cido l ctico y dos las metabolizan para formar cido ac tico y f rmico; parte del acetato pasa a etanol y parte del f rmico a CO2y H2en cantidades de Metilo/Voges ProskauerFermentaci n butilenglic lica: en sta, parte del piruvato se metaboliza produciendo cantidades menores de cido l ctico, f rmico y ac tico, la mayor parte del piruvato se condensa formando acetilmetilcarbinol, que es reducido a 2,34butilenglicol, productos que son neutros.

9 Para determinar la presencia de los productos neutros ( prueba de Voges4 Proskauer): Se agrega un poco de 4naftol al 5% en etanol (medio adquiere aspecto lechoso), luego se le a ade (KOH 40%) que desaparece el aspecto lechoso, se agita fuertemente. ( prueba positiva color rosado 4 viol ceo en la parte superior del tubo; prueba negativa no tiene coloraci n).Utilizaci n de citratoPrueba negativa prueba positivaMedio de Citrato de SimmonsSustrato: Citrato de a: Varias dependientes del pH del : Acetato/formato en condiciones alcalinas y Acetato, CO2, lactato/Aceto na y CO2en condiciones : Azul de bromotimol.

10 Un microorganismo que puede utilizar el citrato como nica fuente de carbono tambi n utiliza las sales de amonio del medio como nica fuente de nitr geno. La extracci n de nitr geno de las sales de amonio producen amoniaco y se alcaliniza el medio virando el indicador al Hierro de Kligler (KIA)Agar hierro de KliglerSustratos: Glucosa , lactosa 1% y Tiosulfato o grupos SH de la ciste na. V a: Fermentativa y Enzimas: Tiosulfato reductasa y ciste na desulfurilasa4 Productos: cidos mixtos y : Rojo de fenol y sales de Fe2+.