TP DE MICROBIOLOGIE N°2

1 TP DE MICROBIOLOGIE N 2 IDENTIFICATION D UN GERMERESPONSABLE D UNE CYSTITEPage 1 PARTIE 1 : IDENTIFICATION D UN GERME RESPONSABLE D cystite est une inflammation de la vessie. C est une infection urinaire qui touche pr f rentiellement les femmes. Elle est le plus souvent d origine bact rienne. Apr s isolement de l urine contamin contaminant dans une g lose BCP on cherche identifier le germe responsable. En MICROBIOLOGIE , la g lose BCP est un milieunon s lectif utilis pour l isolement et la d tection et l isolement des ent robact ries dans l eau, les produits alimentaires, l urine et les sellesOBJECTIFS DE LA MANIPULATION R aliser un tat-frais et l observer R aliser une coloration de Gram et comprendre son principe R aliser un test de mise en vidence de l oxydase R aliser un ensemencement sur g lose nutritive Utiliser et comprendre le principe de l h matim tre de OBSERVATIONS MICROSCOPIQUES On travaille dans un milieu st rile l aide d une flamme g n r e par un bec Bunsen.

2 Apr s toutemanipulation, les lames sont plac es dans l eau de javel pour tre d contamin 1 e manipulation : R alisation d un tat frais du contaminant .L tat frais est l observation des bact ries sous forme vivante. Les bact ries sont pr lev es sur un milieu liquide favorable leur mobilit .A l aide d une pipette Pasteur, on pr l ve quelques gouttes de contaminant que l on place sur une lame en dessinant des cercles afin de cr e des bulles (espace air/liquide). On d pose ensuite une lamelle sur la observation se r alise au microscope optique au grossissement x40 ; la mise au point est r alis e entre l air et l 2 Ces observations nous permettent de conclure sur la forme, la taille, le groupement etla mobilit des bact ries. En effet, en milieu sec de nombreuses bact ries ne produisent pas de flagelles, il serait donc impossible pour nous de conclure sur la mobilit.

3 C est pour cela qu on observe en milieu r sultats obtenus au microscope sont pr sent s dans le tableau suivant :FormeBacillesTaille1 x 3 mGroupementIsol s ou par deuxMobilit et ciliature suppos eMobiles ciliature suppos e p ritriche Repr sentation sch matique de l e Manipulation : r alisation et observation d une coloration GramPage 3 X1000 OBSERVATION MICROSCOPIQUE DES BACILLES APRES COLORATION DE GRAMU rine au microscope optique X1000d apr s le site coloration de Gram est une technique de coloration qui tr s utilis e dans l' tude et la classification des bact ries en deux grands groupes : les bact ries Gram positif et Gram n principe de cette m thode, mise au point par le m decin danois Gram en 1884, est le suivant :Cette m thode de coloration repose sur une diff rence fondamentale entre la composition chimique des parois des bact ries Gram positif.

4 On observe la lame finaleau microscope l objectif x100, les observations sont report es dans le tableau qui suit :Page 4 FormeBacilles droitsTaille1 x 3 mGroupementIsol s ou par deuxR sultat de la coloration de GramBact ries color es en rose : Gram n EN EVIDENCE DE L OXYDASELes bact ries poss dant l enzyme oxydase peuvent oxyder le N-dim thyl-paraph nyl ne diamine en formant un produit violet. En milieu st rile, sur une lame, on place un papier buvard imbib de substrat. On d pose ensuite une suspension de bact rie sur le papier. La r action a lieu au bout de 15 secondes. Si Papier violet = enzyme poss de une oxydase Si Papier incolore = l enzyme ne poss de pas d oxydaseEn conclusion, nous avons proc d la manipulation pr c dente en utilisant la suspension du contaminant.

5 Le r sultat obtenu est n gatif. On peut donc en conclure que notre bact rie ne poss de pas l oxydase et on suppose avec ces quelques r sultats qu elle appartient la famille des D UN ISOLEMENT BACTERIEN SUR GELOSE NUTRITIVEUn isolement bact rien permet d obtenir des colonies isol es et donc des cultures pures. Le principe repose sur une m thode d puisement. En effet, on r alise des talements de la suspension bact rienne sur la g lose en milieu st rile, dans un sens d termin afin d obtenir des bact ries les plus isol es possibles. Les talements sont r alis s selon la m thode des cadrans : on s pare la bo te de P tri en 3 parties et on tale l aide d une anse de pipette pasteur comme suit :Page 5 Apr s une nuit d incubation (environ 15H) 37 C, on observe la pr sence de colonies plus ou moins tal es :FormeRonde et r guli re Bord R guli reTailleDe l ordre du micronSurfaceLisseReliefSemi-bomb RefletBrillantLumi re transmiseTranslucidePigmentation Incolore Les diff rentes caract ristiques relev es dans le tableau pr c dent permettent de conclure qu il s agit d une bact rie de type S.

6 D autres tests ont permis de r v ler d autres particularit s de la bact rie responsable de l inflammation. Soit en r capitulant tous nos r sultats : L tat frais conclut sur une bact rie bacille mobilit p ritriche, La coloration de Gram un bacille Gram n gatif, Le test l oxydase montre qu elle n en poss de pas, La culture sur g lose relativement facile un bacille de type S, Le test respiratoire permet de dire que cette bact rie est a ro-ana robie facultative, Le test de Hugh et Leifson nous r v le que celle-ci est fermentative du glucose, Le test de r duction des nitrates est 6 Ils nous permettent donc de confirmer qu il s ait d une bact rie de la famille des Enterobacteriaceae qui constitue un groupe de bact ries fr quemment rencontr es en pathologies infectieuses comme dans les industries.

7 Inflammation est donc caus e par une bact rie de la famille des Enterobacteriaceae. On peut tre plus pr cis en ce qui concerne l identit de la bact rie responsable notamment laide d une galerie API qui est repr sent e sous formes de petits tubes permettant de r aliser ais ment des tests biochimiques. Le principe d utilisation d une galerie API est le m me que celui du complexe enzyme/substrat ; chaque cupule contient un substrat diff rent sur lequel va r agir le microorganisme. La galerie API 20 E est la plus utilis e en ce qui concerne l identification des ent robact riescomme E. coli par 7 PARTIE 2 : DENOMBREMENT D UNE CULTURE DE LEVURE A L AIDE DEL HEMATIMETRE DE MALASSEZN otre but est de r aliser le suivi d une fermentation d une croissance de levures par d nombrement diff rent temps principe du d nombrement consiste pr lever l chantillon num rer et le placer dans un volume connu contenu dans une cellule de comptage d une lame microscopique en verre.

8 Mat riels et m thodesLe quadrillage est constitu d un grand rectangle (ABCD) de 2,5mm de longueur et de 2 mm de est divis en 100 rectangles gaux (25 clairs, 50 divis es en bandes, 25 divis s en 20 petits carr s).La chambre parall l pip dique correspond au grand rectangle un volume total de V=2 ,5*2*0,20=1mm3Le parall l pip de correspond chaque rectangle un volume de :V=0,25*0,20*0,20=0,01mm3On dispose de 5 solutions de levure pr lev es respectivement aux temps T=0, T=40min, T=80min, T=120min, T=160min et d une lamelle compos es de p10 cupules munis d h matim tre. Apr s homog n isation des solutions, on remplies chaque cupule l aide d une pipette (en veillant bien disposer une solution par cupule). On d nombreles unit s de levures au microscope optique l objectif x40 apr s avoir v rifi la r partition homog ne des 8 CDABLors du d nombrement on compte au moins 10 et au plus 100 cellules par unit desurface sur une dizaine de carr s en prenant en compte les l ments cheval sur les limites.

9 On trouve les r sultats suivants :T0T40T80T120T16018 1955801359163455901115488116611183979120 On constate effectivement une augmentation en nombre des levures au cours du temps. Si on analyse les 2 premiers r sultats surlign s de la premi re ligne, on observe qu ils sont assez proches, on peut donc consid rer une phase de latence (A) au d but de la croissance. Apr s cette phase on distingue une augmentation r guli re la repr sentation graphique de cette croissance est une courbe exponentielle comme suit :012345612345courbe de croissance d'une population de levures diff rents temps T tempsnombre de cellules Il s agit d une m thode de d nombrement indirecte relativement simple r aliseret surtout peu co teuse. Il existe d autres m thodes de d nombrement par exemple l Page 9compteur de particule qui est une m thode de comptage directe qui permet de d terminer le nombre et la dimension des particules pr sentes dans un 10